Alors que la pandémie du COVID-19 se poursuit, les scientifiques continuent de rechercher de nouvelles méthodes pour prédire ou détecter les changements précoces de la prévalence de l'infection afin d'aider à élaborer des stratégies de santé publique plus efficaces et à contenir sa propagation. Une nouvelle étude publiée sur le serveur de pré-impression medRxiv * en septembre 2020 décrit la mesure des protéines du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère dans les eaux usées comme un moyen fiable de suivre le virus dans la communauté.
Sommaire
Détection du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées par l'ARN
L'ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées a récemment gagné du terrain en tant que méthode pour comprendre la prévalence du COVID-19 dans une communauté, en utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier l'acide nucléique. Cependant, les faibles niveaux d'ARN viral fécal et l'instabilité de l'ARN, aggravée par un environnement chaud dans de nombreux cas, ainsi que l'exposition à des produits chimiques et à des conditions sévères, signifient que des seuils de cycle supérieurs à la limite de détection de la technologie sont souvent nécessaires. pour l'amplifier à des niveaux détectables.
Un autre inconvénient de cette technologie est que la préparation des eaux usées nécessite un traitement intensif, ce qui la rend plus coûteuse et plus lourde.
Utilisation du MPAD pour la détection des protéines virales dans les eaux usées
Pour surmonter ces obstacles, les chercheurs ont examiné la faisabilité de mesurer les protéines virales à la place, car celles-ci sont présentes à une charge plus élevée et sont plus stables. L'étude actuelle utilise le MPAD (Multiplex Paired-anticorps Amplified Detection), qui est remarquable pour coupler la spécificité des anticorps avec la capacité d'amplification du signal de la PCR. L'objectif était d'évaluer la capacité de cette méthode à signaler la présence du virus de manière plus forte et plus fiable, à l'aide d'échantillons d'eaux usées provenant de deux installations de récupération des eaux usées d'Ottawa.
Ottawa, au Canada, a une faible prévalence du COVID-19 et moins de 10 cas sont signalés quotidiennement pour 100 000 habitants. Néanmoins, la même équipe de chercheurs avait déjà découvert des niveaux détectables de protéines virales dans des échantillons d'eaux usées. Ils ont choisi cette ville car elle fournirait une norme utile pour la sensibilité des tests en termes de détection virale. Ils ont également décidé d'utiliser les admissions quotidiennes à l'hôpital comme mesure de l'excrétion virale dans la communauté, de préférence aux tests positifs, puisque le premier est relativement inchangé et plus précis.
Les niveaux de protéines structurales et d'ARN du SRAS-CoV-2 des eaux usées d'Ottawa correspondent aux hospitalisations liées au COVID-19. Cercles roses (de la figure 5): axe Y gauche; Le MPAD a déterminé les niveaux de protéines N, S et M des solides influents précipités par le PEG d'Ottawa par rapport au 8 avril 2020 (fixés à une valeur de 1,0), normalisés en géomée de six protéines de contrôle fécales (voir méthodes). Dates de collecte spécifiées sur l'axe X (aucun échantillon n'a été analysé pour le 10 juin). Les barres d'erreur représentent l'écart type entre les répliques. Triangles et carrés noirs (D'après D’Aoust et al., 2020) 8: axe Y gauche; La RT-PCR a généré l'ARN viral des boues primaires précipitées par le PEG d'Ottawa (triangle creux N1 et carré plein N2) par rapport au niveau le 8 avril (fixé à une valeur de 1,0) normalisé à PMMoV. Dates de prélèvement spécifiées sur l'axe X, y compris les échantillons supplémentaires les 17 et 19 juin. Cercles gris: axe Y droit, somme de 14 jours (durée médiane estimée de l'excrétion virale fécale) des admissions quotidiennes à l'hôpital, approximation des excréteurs viraux actifs dans la communauté.
Maximiser l'avantage MPAD
MPAD utilise la PCR quantitative, tout comme la qRT-PCR utilisée pour la détection de l'ARN viral. Cela signifie que les seuils de cycle peuvent être directement comparés, ainsi que le signal pour la détection des protéines par rapport à la détection de l'ARN. Le MPAD permet également d'analyser simultanément plusieurs protéines virales pour augmenter la spécificité de la détection.
Les eaux usées sont un système très variable en ce qui concerne le débit, la masse, le type et la concentration d'organismes et d'autres caractéristiques vitales. La stabilité de l'ARN varie également avec les conditions. Les chercheurs ont utilisé une technique de marqueurs multiples pour standardiser l'échantillon d'eaux usées en termes de contenu fécal.
Ils ont donc combiné un virus fécal de substitution, PMMoV, qui s'est avéré auparavant être la plus fiable de trois approches différentes, et cinq autres marqueurs de contenu, y compris deux virus et trois protéines humaines, avec les trois protéines SARS-CoV-2 pour être analysé. Ces marqueurs de contenu ont permis à chacune des trois protéines d'être normalisée aux six marqueurs de contenu fécal, à la fois séparément et en combinaison.
Ils ont également vérifié la corrélation entre les marqueurs pour chaque protéine, en comparant les niveaux normalisés aux témoins individuels par rapport aux témoins agrégés. Cela a confirmé une normalisation très supérieure à atteindre avec cette combinaison de marqueurs, avec la meilleure précision et comparabilité.
Les chercheurs remarquent: «La spécificité et la normalisation robustes découlant de la mesure des 9 niveaux de protéines (3 SAR-CoV-2, 6 marqueurs de contrôle fécal) avec ce panel de protéines multiplex unique représentent un avantage significatif dans tout programme de surveillance des eaux usées à grande échelle.. »
Taux de détection nettement plus élevés dans les échantillons internationaux
Lorsqu'il est traité par dosage quantitatif MPAD, il a été trouvé que le signal était de plusieurs ordres de grandeur plus élevé que pour l'ARN en utilisant qRT-PCR. Dans les boues primaires, le signal de la protéine virale était de 64 à 208 fois plus élevé, tandis qu'avec les solides influents, il était de 20 à 128 fois plus significatif que pour l'ARN viral dans les mêmes échantillons.
Cependant, ces signaux proviennent de plusieurs villes avec un large éventail de prévalence. Une fois ajustée, la différence de signal entre la protéine et l'ARN varie de 400 à 6 500 fois plus élevée dans les boues primaires et de 100 à 1 000 fois dans les solides affluents.
Le signal était en corrélation avec l'ARN et également l'incidence estimée de l'infection sur les 10 semaines de la période d'étude.
Test d'échantillons d'Ottawa
Avec les échantillons d'Ottawa, les chercheurs ont d'abord effectué des analyses par Western blot pour rechercher la présence du virus dans les eaux usées. Leurs résultats ont confirmé ceux de la spectroscopie Raman, la protéine de pointe étant présente dans tous les échantillons d'une série prélevée au fil du temps, contrairement à l'ARN viral, qui n'était présent que dans les échantillons les plus en amont. La quantité de protéine membranaire virale détectée correspond à la tendance de l'ARN viral.
Ils ont ensuite mesuré les protéines en utilisant MPAD dans le cadre du panel élargi. Ils ont découvert qu'ils étaient capables de détecter l'ARN viral dans les solides influents à quatre des sept dates, mais des protéines dans tous les échantillons à l'aide du MPAD. Cela pourrait être dû au fait que la teneur en protéines est plus élevée parce que le MPAD est plus sensible que la qRT-PCR ou les deux facteurs.
Deuxièmement, l'ARN viral dans les solides influents n'était pas en corrélation avec celui des boues primaires, avec le signal de la protéine virale ou avec les données cliniques. Ils ont conclu que le signal d'ARN viral dans les solides influents était probablement à la limite de détection de la qRT-PCR et ne serait pas un bon indicateur du titre viral dans les eaux usées, par rapport aux boues primaires.
Dans ce dernier, l'analyse des protéines virales MPAD a produit un signal qui correspond à la tendance temporelle correspondante observée dans les solides influents, ainsi que le total glissant de 14 jours des admissions à l'hôpital pour COVID-19.
Implications et orientations futures
Les chercheurs ont conclu qu'il était possible de détecter et de mesurer les protéines structurales du virus dans les boues primaires après précipitation au PEG. Les données suggèrent également la présence d'un virus intact, bien que l'infectivité des eaux usées n'ait pas été confirmée. Enfin, ce panel a pu contrôler la forte variabilité de la surveillance de la prévalence basée sur les eaux usées.
Cette découverte, disent-ils, aidera à étudier l'épidémiologie de la maladie, étant plus sensible à la présence du virus que les méthodes basées sur la détection d'ARN. En outre, en fournissant une alerte précoce, il peut aider à suivre la charge virale dans la communauté en tant que méthode de surveillance relativement simple, que ce soit pour les institutions, les écoles ou les foyers.
Les mesures de l'ARN viral et des protéines dans les selles en relation avec l'activité clinique du virus suggèrent que le virus est excrété dans les selles pendant environ 14 jours (valeur médiane). Cela suggérerait que le total glissant des admissions quotidiennes pour les 14 derniers jours avant un jour donné indique le nombre de personnes hospitalisées qui excrètent le virus à une date donnée.
Cependant, une période d'étude plus longue est nécessaire pour comprendre dans quelle mesure les protéines virales dans les eaux usées concordent avec la prévalence. Un échantillonnage plus fréquent au cours de cette période montrera les tendances temporelles changeantes de la prévalence communautaire. Néanmoins, l’étude conclut: «Les mesures virales protéiques de cette étude ont bien suivi avec cette estimation limitée de la charge virale communautaire et avec une sensibilité largement supérieure à celle du suivi de l’ARN viral.»
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.