Une étude invalide Ebselen et d'autres inhibiteurs à large spectre du SARS-CoV-2 Mpro

La pandémie actuelle de COVID-19 est causée par un virus à ARN monocaténaire enveloppé, le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2). Il provient du genre des bétacoronavirus qui comprend également les deux virus hautement pathogènes qui ont provoqué des épidémies antérieures de maladies respiratoires – SRAS-CoV et MERS-CoV – ainsi que deux autres coronavirus humains (CoV), HCoV-OC43 et HCoV-HKU1 .

Le SARS-CoV-2 actuel a une séquence d'ARN, qui est similaire à environ 80% à celle du SARS-CoV, et donc de nombreux antiviraux qui semblent être actifs contre lui ont d'abord été développés contre ce dernier ou un autre CoV. Une de ces catégories de médicaments est celle des principaux inhibiteurs de protéase.

L'importance de Mpro

Le SRAS-CoV-2 pénètre dans la cellule hôte en s'engageant avec le récepteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2), exprimé sur les cellules hôtes cibles. Suite à son attachement au récepteur, il pénètre dans la cellule par fusion membranaire ou par internalisation dans les endosomes. Dans le cytoplasme de la cellule hôte, l'ARN viral est traduit en deux grandes polyprotéines. Celles-ci sont clivées en plusieurs protéines non structurales, dont les deux protéases virales, la protéase principale (Mpro), également appelée protéase de type 3-chymotrypsine (3CLpro), et la protéase de type papaïne (PLpro).

Avec d'autres enzymes essentielles comme le complexe ARN polymérase dépendante de l'ARN viral (RdRp), ces protéases sont cruciales pour la réplication virale. Toute interférence avec une partie quelconque du cycle de vie viral arrêtera donc également la réplication virale. Ainsi, l'une des cibles médicamenteuses les plus importantes à l'honneur de la recherche contre le SRAS-CoV-2 est le Mpro.

Le Mpro est une cystéine protéase qui produit 11 coupes ou plus dans la grande polyprotéine virale. Il convient également à l'inhibition par des composés qui épargnent les protéases de la cellule hôte en raison de la préférence unique pour une glutamine P1 sur le substrat. Cette préférence est partagée par de nombreuses autres enzymes MPro virales, y compris le rhinovirus, le norovirus et l'entérovirus.

Inhibiteurs spécifiques de Mpro

En conséquence, plusieurs inhibiteurs puissants de cette enzyme ont été conçus, qui contiennent tous une substitution glutamine-mimétique de la 2-pyrrolidone à P1. Il s'agit notamment des inhibiteurs du rhinovirus humain Mpro Rupintrivir (AG7088) et AG7404, et GC376, un antiviral à large spectre inhibant à la fois le SARS-CoV et le MERS-CoV in vitro. Des études in vivo chez des chats infectés par le virus de la péritonite infectieuse féline ont confirmé son activité antivirale.

Nouveaux inhibiteurs

D'autres nouveaux composés ayant une activité inhibitrice de Mpro ont également été revendiqués comme ayant une activité antivirale. Ceux-ci comprennent l'ebselen, le disulfirame, le tideglusib, le carmofur, la shikonine et le PX-12. Un nouveau document de recherche rédigé par des scientifiques de l'Université d'Arizona et de l'Université nationale et kapodistrienne d'Athènes et publié sur le serveur de pré-impression bioRxiv* discute du rôle de ces molécules en tant qu'inhibiteurs potentiels de Mpro dans la prévention de l'infection par le SRAS-CoV-2.

Ebselen a une activité anti-inflammatoire et anti-oxydante. Ebselen et ses analogues ont une activité anti-Mpro et anti-PLpro. Cependant, il aurait également une activité non spécifique contre de nombreuses protéines non apparentées.

Le disulfirame a également une large activité inhibitrice contre plusieurs enzymes comme la méthyltransférase, l'uréase et la kinase via leurs résidus cystéine. Il a été rapporté qu'il inhibe le SRAS-CoV et le MERS-CoV PLpro à des concentrations micromolaires. Pourtant, cet effet est facilement annulé par le β-mercaptoéthanol, un agent réducteur qui est ajouté à un dosage enzymatique typique.

Carmofur inhibe la céramidase acide humaine par modification covalente, tandis que PX-12 inhibe la polymérisation de la tubuline. Tideglusib est un inhibiteur irréversible de la glycogène synthase kinase-3β (GSK-3β).

Test d'activité inhibitrice et antivirale

Parmi les six composés, l'ebselen seul a inhibé la réplication du SARS-CoV-2 à une concentration micromolaire, tandis que le disulfirame l'a réduit d'un tiers. Les chercheurs ont cherché à savoir si ces composés peuvent spécifiquement inhiber Mpro, ou est-ce qu'ils l'inactivent simplement par l'un de plusieurs mécanismes non spécifiques? Si tel est le cas, leur activité antivirale dans la cellule hôte reflète-t-elle la puissance de l'inhibition enzymatique en termes de concentration inhibitrice (IC50)?

Les chercheurs ont donc testé les six composés pour leur activité inhibitrice contre un panel de cystéine protéases virales, à savoir le SARS-CoV-2 Mpro et PLpro, la protéase 2A (2Apro) et la protéase 3C (3Cpro) d'EV-A71 et EV-D68 avec et sans ajout de l'agent réducteur DTT. Parmi ceux-ci, EV-A71 3Cpro et EV-D68 3Cpro ont des propriétés de pliage similaires à celles de Mpro, les autres étant différents.

Ils ont utilisé plusieurs tests, y compris un test enzymatique, un test de liaison par décalage thermique et un test de spectroscopie de masse (MS) native.

Test de liaison par déplacement thermique des protéases SARS-CoV-2, EV-A71 et EV-D68 contre les inhibiteurs étudiés dans cette étude. (A) SARS-CoV-2 Mpro; (B) SARS-CoV-2 PLPro; (C) EV-A71 2Apro; (D) EV-A71 3Cpro; (E) EV-D68 2Apro; et (F) EV-D68 3Cpro. 3 µM de protéase dans son tampon de réaction enzymatique correspondant en présence de 4 mM de DTT ou en l'absence de DTT ont été pré-incubés avec du DMSO ou 40 µM d'inhibiteurs de protéase (la shikonine a été testée à 10 µM car 40 µM de shikonine éteint complètement la fluorescence du colorant orange SYPRO signal) à 30 ° C pendant 30 min. La température de fusion (Tm) a été calculée comme le journal moyen de la phase de transition de la protéine native à la protéine dénaturée en utilisant un modèle de Boltzmann. 32 * indique qu'un pic de fluorescence n'a pas été observé dans la courbe de fusion; La ligne en trait rouge montre la protéase Tm avec du DMSO en présence de 4 mM de DTT.

Test de liaison par déplacement thermique des protéases SARS-CoV-2, EV-A71 et EV-D68 contre les inhibiteurs étudiés dans cette étude. (A) SARS-CoV-2 Mpro; (B) SARS-CoV-2 PLPro; (C) EV-A71 2Apro; (D) EV-A71 3Cpro; (E) EV-D68 2Apro; et (F) EV-D68 3Cpro. 3 µM de protéase dans son tampon de réaction enzymatique correspondant en présence de 4 mM de DTT ou en l'absence de DTT ont été pré-incubés avec du DMSO ou 40 µM d'inhibiteurs de protéase (la shikonine a été testée à 10 µM car 40 µM de shikonine éteint complètement la fluorescence du colorant orange SYPRO signal) à 30 ° C pendant 30 min. La température de fusion (Tm) a été calculée comme le logarithme moyen de la phase de transition de la protéine native à la protéine dénaturée en utilisant un modèle de Boltzmann.32 * indique qu'un pic de fluorescence n'a pas été observé dans la courbe de fusion; La ligne en trait rouge montre la protéase Tm avec du DMSO en présence de 4 mM de DTT.

Inhibition non spécifique

Ils ont constaté qu'en présence de DTT, aucun d'entre eux n'était capable d'inhiber Mpro. Cependant, sans DTT, tous les six avaient une large activité inhibitrice contre toutes les protéases virales, en particulier contre le 2Apro et le 3Cpro de EV-A71 et EV-D68. Cela indique l'apparition d'une inhibition non spécifique due à une alkylation ou à l'oxydation du résidu cystéine.

L'addition d'un agent réducteur empêche de tels effets, qui devraient être inchangés dans le cas d'un inhibiteur de cystéine protéase spécifique.

Deuxièmement, ils ont observé à travers des simulations de dynamique moléculaire (MD) que ces composés se lient au SARS-CoV-2 Mpro à faible affinité, ce qui soutient leur mécanisme non spécifique d'inhibition. Seul le carmofur a éventuellement une activité spécifique contre Mpro, mais une faible puissance.

Ainsi, ils résument: «WNous fournissons des preuves convaincantes suggérant qu'ebselen, disulfirame, tideglusib, carmofur, shikonine et PX-12 sont des inhibiteurs non spécifiques du SARSCoV-2 Mpro. »

Aucune activité antivirale cellulaire

Là encore, ces composés n'ont pas réussi à supprimer la réplication de l'un ou l'autre de ces virus à la concentration la plus élevée compatible avec la sécurité. En d'autres termes, ils ont conclu: « Le pouvoir d'inhibition enzymatique des inhibiteurs de cystéine protéase obtenus en l'absence de DTT ne peut pas être utilisé pour prédire l'activité antivirale cellulaire. »

Malgré le besoin urgent d'antiviraux efficaces pour contenir la pandémie en cours, les scientifiques doivent encore faire preuve de rigueur pour identifier des composés antiviraux spécifiques plutôt que des impacts plus larges. Ainsi, tous les composés prometteurs doivent être testés tôt au cours du développement par des tests secondaires pour exclure l'activité non spécifique.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.

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