La résurgence de la pandémie actuelle de coronavirus 2019 (COVID-19) a renforcé la nécessité d’un diagnostic rapide et fiable de l’infection avec son agent causal, le syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus-2 (SRAS-CoV-2).
Un nouveau papier imprimé dans le serveur de pré-impression medRxiv* rapporte des résultats supérieurs en utilisant un protocole de test alternatif pour le test de réaction en chaîne par polymérase quantitative de transcriptase inverse (RT-qPCR) en temps réel pour ce virus.
La protéinase K améliore les performances de la méthode d’inactivation thermique dans les déterminations RT-qPCR du SARS-CoV-2. Crédit d’image: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.12.16.20248350v1.full.pdf
La nécessité d’accélérer RT-qPCR
Alors que RT-qPCR est l’étalon-or pour le diagnostic de l’infection par le SRAS-CoV-2, le protocole suivi actuellement nécessite l’extraction d’ARN, pour produire le substrat d’ARN purifié pour l’enzyme polymérase. Non seulement cette étape ajoute du temps, si elle est effectuée manuellement, mais elle nécessite des réactifs coûteux qui peuvent facilement manquer de stock dans des conditions de forte demande, comme actuellement. L’alternative est l’utilisation de robots, ce qui ajoute à la dépense. L’extraction de l’ARN du virus nécessite également des installations de niveau de sécurité biologique 2 (BSL2).
Tous ces obstacles créent des goulots d’étranglement indésirables dans les procédures de test. Commentaire de l’auteur: «En Argentine, un technicien de laboratoire qualifié traite environ 24 échantillons toutes les 1,5 heure.» Ceci est nettement insuffisant pour répondre aux exigences actuelles.
Méthodes alternatives
De nombreux chercheurs travaillent sur des méthodes qui évitent cette étape. Plusieurs articles décrivent l’utilisation de l’inactivation thermique avec une détection haute sensibilité des régions de nucléocapside courtes de l’ARN viral qui survivent intactes à l’étape de chauffage. Les différents supports pouvant être utilisés avec cette technologie sont également décrits dans des études antérieures.
Une autre approche est l’utilisation de la protéinase K (PK). Il s’agit d’une enzyme protéase qui décompose les RNases, empêchant ainsi la dégradation de l’ARN. L’utilisation de PK peut ainsi aider à préserver intact l’ARN viral lors des protocoles d’inactivation thermique, mais au prix d’une certaine sensibilité.
Détails de l’étude
L’étude actuelle, qui est apparue sous forme de pré-impression sur le medRxiv serveur, décrit un protocole qui combine à la fois l’inactivation PK et thermique, déterminant avec succès la présence d’ARN de SARS-CoV-2 par RT-qPCR.
Le test a été réalisé sur des écouvillons nasopharyngés obtenus lors du dépistage des cas symptomatiques non hospitalisés et de leurs contacts étroits. Les écouvillons ont été conservés jusqu’à 24 heures dans une solution saline et ajoutés à des tubes prétraités avec PK. Cette étape minimise la manipulation d’échantillons potentiels contenant des virus puisque ces tubes ne sont ensuite manipulés qu’après inactivation.
De plus, cette étape peut être effectuée en dehors de la zone de traitement des virus, ce qui permet d’étendre considérablement le flux de travail.
Les chercheurs ont ensuite chauffé les échantillons avant de passer à RT-qPCR pour la détection de plusieurs gènes viraux, à savoir, N1 et, N2; N et ORF1; et N, E et RdRp, avec des contrôles du gène RP humain, dans différents dosages. Ils ont également réalisé des tests d’infectivité en utilisant les mêmes échantillons, pour assurer l’inactivation.
Les gènes viraux N, E, ORF1a et ORF1b ont été amplifiés en utilisant une amplification isotherme à médiation en boucle (LAMP). Enfin, ils ont calculé les efficacités des différents tests PCR et analysé les courbes d’amplification.
Avantages de l’ajout de PK
Le virus s’est avéré être inactivé, comme le montrent les tests d’infectivité qui n’ont montré aucun effet cytopathique ou détection d’ARN viral par RT-qPCR subséquente du surnageant.
Ils ont constaté que la préincubation PK conduit à une meilleure performance du test PCR après l’inactivation thermique. La solution saline utilisée dans ce cas a produit des résultats optimaux, contrairement aux rapports précédents. Il est à noter que le CDC recommande également ce moyen de transport.
Tous les échantillons ont été correctement identifiés comme positifs ou négatifs après des protocoles d’inactivation thermique ou d’inactivation thermique PK. Ce dernier a réduit le nombre de cycles nécessaires pour détecter l’ARN par rapport au premier, comme le montrent les valeurs de seuil de cycle plus basses, qui étaient plus comparables à celles déterminées à l’aide de l’ARN extrait.
En d’autres termes, l’efficacité était maximale pour l’extraction d’ARN suivie de RT-qPCR, puis pour l’inactivation thermique PK, et la plus faible pour l’inactivation thermique seule. Ainsi, la pharmacocinétique peut réduire la concentration de substances inconnues qui interfèrent avec le test.
Le gène N1 a montré une meilleure efficacité par rapport à N2, comme l’ont rapporté d’autres chercheurs. Le nombre de copies d’amplicon avec des échantillons d’inactivation thermique PK par rapport à celui avec inactivation thermique seule était plus élevé pour N2 et RP, peut-être parce que PK empêche ces régions d’être également décomposées par la RNase.
L’ajout de PK augmente la dilution, ce qui pourrait contribuer à l’efficacité globale de la détection. À des volumes plus élevés, encore une fois, la sensibilité de détection augmente dans les échantillons avec de faibles titres de virus. Cependant, il était indépendant des concentrations PK comprises entre 0,1 et 1 mg / ml, permettant des tests encore moins chers et augmentant également la fiabilité des résultats des tests.
Haute sensibilité de détection
Lorsque la détection du seul contrôle du gène N1 et du gène RP humain a été directement comparée à des échantillons d’ARN purifié, les échantillons sans extraction PK-inactivés par la chaleur ont montré une sensibilité et une spécificité de 100%, avec des valeurs Ct très similaires, montrant que la nouvelle méthode reflète avec précision le présence du virus.
Les chercheurs ont également étudié l’utilisation de cette méthode d’inactivation PK-chaleur avec des kits multiplexés qui détectent d’autres gènes dans de multiples réactions. Par exemple, DisCoVery (ciblant les gènes N et ORF1ab) et Genefinder (ciblant les gènes N, E et RdRp) ont été utilisés ici et sont couramment utilisés dans des situations cliniques.
Les résultats montrent qu’il n’y a pas de variation dans la détection de ces échantillons préparés par l’une ou l’autre méthode, même avec des valeurs Ct supérieures à 35. Malgré la détection plus faible de E et RdRp avec le Genefinder par rapport à N, le test était encore très sensible pour l’ARN viral détection.
Ils ont trouvé des efficacités d’amplification similaires pour les gènes N, ORF1ab et RP par les deux méthodes. Ces échantillons peuvent être conservés à 4 ° C après une inactivation PK-heat pendant jusqu’à 20 heures, ou congelés-décongelés, sans aucune modification des valeurs Ct. Les tests de validation ont montré une précision de 99%, avec une sensibilité et une spécificité de 99%.
Quelles sont les implications?
L’utilisation de PK suivie d’une inactivation thermique est un protocole fiable pour la détection RT-qPCR de SARS-CoV-2 sans extraction d’ARN. Cette méthode peut également être combinée avec les kits LAMP, qui sont largement utilisés en raison de leur commodité et de leur bon marché.
La simplicité et la période relativement courte requise pour le protocole et la disponibilité totale et le prix bas des réactifs requis font de PK + HID une alternative bon marché, simple et rapide aux protocoles d’extraction d’ARN traditionnels.. »
S’il est validé, cela pourrait fournir une voie de test alternative qui soit flexible pour les tests multiplex, peu coûteuse et précise. Cela pourrait entraîner une nette amélioration de la capacité de test dans les environnements à faibles ressources.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.
