Un protocole de calcul automatisé identifie un inhibiteur potentiel du SARS-CoV-2 MPro

Alors que les scientifiques se précipitent pour découvrir de nouveaux médicaments antiviraux efficaces contre le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), de nombreuses nouvelles approches sont utilisées. Maintenant, une nouvelle étude publiée sur le preprint bioRxiv * en septembre 2020, un rapport sur la découverte d'un bloqueur enzymatique potentiellement bénéfique qui pourrait inhiber la réplication virale du SRAS-CoV-2.

Importance des inhibiteurs covalents

Au cours des dix dernières années, des molécules covalentes qui inhibent de manière irréversible les enzymes virales sont entrées en jeu à la fois pour comprendre diverses structures moléculaires et pour une utilisation en thérapeutique. Très souvent, ces inhibiteurs irréversibles médient leurs effets via des liaisons covalentes formées à travers un résidu cystéine.

Les chercheurs ont essayé de concevoir de tels inhibiteurs et plusieurs d'entre eux ont été approuvés par la Food and Drug Administration (FDA), notamment l'ibrutinib et l'afatinib. Cet intérêt est dû au fait que de tels médicaments sont soutenus dans leur action et inhibent l'activité de l'enzyme sur ses substrats naturels en rivalisant avec eux pour les sites de liaison, même lorsque ces derniers ont une forte affinité pour l'enzyme. Ils peuvent être conçus pour cibler les résidus de cystéine non conservés pour une plus grande sélectivité. Enfin, les liaisons covalentes peuvent être formées même pour des cibles difficiles telles que la molécule oncogénique K-Ras avec la mutation G12C.

Covalentizer récapitule avec succès les inhibiteurs covalents de kinase connus. Exemples d'inhibiteurs de kinases covalentes (vert) pour lesquels le covalentiseur a pu trouver une correspondance de sous-structure (magenta) sous le seuil de 1,5 Â. A. ERK2, PDB: 4ZZO. B. EphB3, PDB: 5L6P. C. EGFR (T790M), PDB: 4I24. D. JAK3, PDB: 5TOZ. Les électrophiles englobent les acrylamides (A, D), un acrylamide substitué (C) et le chloroacétamide (B).

Covalentizer récapitule avec succès les inhibiteurs covalents de kinase connus. Exemples d'inhibiteurs de kinases covalentes (vert) pour lesquels le covalentiseur a pu trouver une correspondance de sous-structure (magenta) sous le seuil de 1,5 Â. A. ERK2, PDB: 4ZZO. B. EphB3, PDB: 5L6P. C. EGFR (T790M), PDB: 4I24. D. JAK3, PDB: 5TOZ. Les électrophiles englobent les acrylamides (A, D), un acrylamide substitué (C) et le chloroacétamide (B).

Recherche d'un nouveau pipeline d'inhibiteurs covalents

À l'heure actuelle, les bibliothèques de fragments covalents sont criblées pour les inhibiteurs covalents, de manière empirique ou virtuelle. Auparavant, ils ont été conçus en ajoutant un électrophile à un inhibiteur réversible existant avec un site de liaison adjacent à un résidu cystéine.

L'approche de criblage est laborieuse car les coups primaires sont souvent de faible affinité de liaison, ce qui signifie qu'ils doivent être soigneusement ajustés pour obtenir une puissance adéquate. Cependant, si un liant réversible connu est dérivé de manière covalente, le composé résultant présente de nombreuses propriétés utiles telles qu'une inhibition dépendant du temps, une action prolongée, une meilleure sélectivité pour les protéines portant la cystéine et peut-être une plus grande puissance.

Pour ce faire, il y a trois aspects à prendre en compte: le bon électrophile, le meilleur vecteur d'échafaudage et le lieur, si nécessaire, qui fournira le bon positionnement du groupe électrophile pour assurer une liaison correcte de l'échafaudage avec la cible cystéine.

Un autre problème est de savoir si l'inhibiteur réversible modifié sera accessible pour la synthèse.

Le pipeline Covalentizer

Pour couvrir tous ces aspects, les chercheurs ont utilisé un algorithme de conception qui peut aider à révéler de nombreux liants covalents puissants pour cibler de nombreuses molécules différentes. Cela fait partie d'une plate-forme de calcul qui aide à identifier les liants réversibles existants qui peuvent ensuite être convertis en analogues covalents.

Ce processus, appelé covalentisation, consiste à ajouter divers groupes électrophiles à la structure complexe ou au modèle d'un ligand adjacent à une cystéine. La collection temporaire de molécules covalentes est ancrée de manière covalente à la cible en utilisant la structure d'origine comme point de référence. Cela aide à identifier les structures covalentes avec un degré élevé de confiance de prédiction.

Cette approche a été utilisée pour évaluer l'ensemble de la PDB, conduisant à l'identification de milliers d'inhibiteurs potentiellement irréversibles.

Pipeline en quatre étapes

Le pipeline de covalentisation comprend quatre étapes, à savoir, la fragmentation, la diversification électrophile, l'amarrage covalent et le filtrage RMSD. Le ligand est ainsi décomposé au niveau des liaisons accessibles à la synthèse, de manière répétée pour obtenir une liste de sous-structures ou de vecteurs auxquels l'électrophile peut être ajouté. A chaque liste, le système d'anneau nu ou non décoré est ensuite ajouté, appelé échafaudage Murcko, pour fournir encore plus de vecteurs de sortie comme sources du prochain électrophile supplémentaire.

La fragmentation du ligand permet l'exposition de nouveaux ligands auxquels l'électrophile peut être ajouté, tout en empêchant également tout déplacement du mode de liaison de la molécule par rapport à la structure cristalline d'origine en raison de contraintes supplémentaires dues à la formation de liaisons covalentes. Le fait de jeter une partie de la molécule d'origine peut améliorer la puissance de l'inhibiteur s'il empêche l'encombrement stérique de la liaison kinase-ligand lorsque le ligand est situé au-delà de l'électrophile.

L'arrimage covalent répond aux décalages de moins d'un angström en largeur. En d'autres termes, cette version allégée peut s'ancrer mieux que le ligand de pleine longueur, et ainsi cette étape maximise le nombre de candidats inhibiteurs.

La diversification des électrophiles a été réalisée en générant une bibliothèque de centaines d'analogues potentiels de quatre types pour chaque structure d'échafaudage. Ceux-ci sont ajoutés à l'échafaudage directement ou via des linkers.

Toutes les formes de rotation de cystéine disponibles sont utilisées pour préparer une structure pour l'amarrage covalent, qui est utilisée pour déterminer les analogues covalents candidats finaux. Pour augmenter la précision de l'amarrage covalent, les ligands sont limités à ceux avec 8 à 25 atomes et 5 liaisons rotatives ou moins.

Enfin, un filtrage RMSD est effectué pour identifier les composés qui peuvent se lier de manière covalente avec le résidu cystéine sans changement du mode de liaison d'origine de l'inhibiteur réversible.

Analyse comparative du pipeline

Le pipeline d'inhibiteurs covalents de kinases a été comparé en démontrant sa capacité à sélectionner 40% des inhibiteurs covalents connus, en utilisant leur composant réversible, à partir d'un sous-ensemble d'inhibiteurs covalents de 35 kinases d'un repère d'amarrage covalent récemment rapporté.

Ensuite, ils sont passés à l'ensemble de l'APB avec près de 45 000 structures. En utilisant le pipeline, ils ont réduit la recherche à ~ 8 400 structures avec un atome de ligand dans l'atome de soufre d'un résidu cystéine libre, se liant à ~ 3 700 ligands.

Cette collection cible a ensuite été regroupée pour éliminer la redondance, ce qui a abouti à un ensemble final d'environ 2 000 structures. Plusieurs catégories d'enzymes sont incluses ici, environ 40% étant des transférases et 11% composées de kinases. Le protocole a généré 80 structures de prédiction analogiques covalentes de très haute confiance.

L'utilisation de lieurs plus longs et plus diversifiés leur a permis de cibler des cystéines plus éloignées pour un espace cible plus grand et l'introduction de groupes chimiques plus divers. Même en limitant leur application au sous-ensemble de kinases dans la PDB, cette étape a élargi la taille de la bibliothèque à plusieurs milliers par inhibiteur réversible.

Le nombre total de composés électrophiles était donc supérieur à 3 millions en utilisant des lieurs di-amine pour les kinases. Parmi les 411 structures protéiques finales candidates à l'inhibition covalente, 186 étaient nouvelles, justifiant cette approche.

Nouveaux inhibiteurs covalents pour diverses kinases

Les chercheurs ont maintenant sélectionné des composés à faible RMSD, une région de liaison de charnière kinase intacte après l'ajout d'électrophile et une facilité de synthèse. La synthèse et les tests ont abouti à la démonstration d'inhibiteurs très puissants dans 5/9 molécules prédites, avec une CI50 dans la plage nanomolaire élevée à micromolaire faible.

La cocristallisation de cette structure a validé la propriété prédictive robuste du modèle de calcul, qui peut être utilisé pour développer rapidement des centaines de nouveaux inhibiteurs à partir de la base de données existante.

Inhibiteur de protéase principal covalent du SRAS-Cov-2

On a remarqué que la première structure rapportée de la nouvelle protéase SARS-CoV-2 Mpro était très similaire au site actif de SARS-CoV Mpro, à une identité de séquence de 96% sur toute la protéine. À la recherche d'un ligand Mpro covalentisé, ils ont trouvé une prédiction basée sur l'inhibiteur réversible à petites molécules ML188.

Bien qu'une liaison irréversible soit présente sous la forme covalentisée, elle n'a pas montré une inhibition puissante. L'optimisation de son affinité de liaison réversible a produit une forme analogue supérieure avec une puissance plus élevée, augmentant son potentiel inhibiteur et empêchant peut-être l'échappement mutationnel viral à long terme. Il est à noter que la procédure permet une synthèse et un test pratiques de grandes bibliothèques analogiques systématiquement.

Implications

Les chercheurs ont montré que l'automatisation du protocole permet une couverture rapide de l'ensemble de la BDP tout en testant la validité de cette nouvelle technique. L'étude démontre la précision prédictive de l'algorithme, montrant grâce à des tests prospectifs utilisant six cibles réelles qu'il est possible d'obtenir des ligands irréversibles sans synthèse significative.

Une caractéristique exceptionnelle est l'utilisation intensive de structures cristallographiques aux rayons X, qui a généré une grande bibliothèque de prédictions prometteuses basées sur un inhibiteur réversible existant, permettant ainsi une synthèse rapide.

Le protocole de covalentisation et la base de données des molécules candidates sont dans le domaine public à https://covalentizer.weizmann.ac.il. Le site Web permet à des milliers de prédictions similaires d'être vues et utilisées par des scientifiques du monde entier, ainsi que de covalentiser des structures nouvellement téléchargées.

Malgré ce succès précoce, le protocole ne considère pas la faisabilité synthétique du candidat final. Encore une fois, les composés finaux sont généralement des inhibiteurs beaucoup plus faibles que les composés d'origine, mais d'autres optimisations sont tout à fait possibles pour améliorer la puissance, comme par une reconnaissance réversible accrue.

L'étude souligne la portée de la découverte de nombreux inhibiteurs après les plus de 1500 à ce jour disponibles sur le site. De nouveaux électrophiles et lieurs peuvent être utilisés pour changer la direction de liaison avec la cystéine. La cystéine peut même être remplacée par d’autres acides aminés si de nouvelles «ogives» covalentes sont utilisées, ce qui augmente considérablement le nombre de ligands.

Les auteurs résument: «Nous montrons qu'en utilisant l'amarrage covalent nous avons pu fabriquer des analogues irréversibles de ligands pour lesquels une structure complexe est disponible. »

Ils ont également découvert de nouveaux inhibiteurs de kinases covalentes, tout en optimisant un inhibiteur irréversible du SARS-CoV-2 Mpro, dans une voie de synthèse bon marché, modulaire et rapide. Cela devrait accélérer la découverte d'inhibiteurs covalents ciblant de nombreuses autres protéines.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.

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