Alors que la recherche d'inhibiteurs efficaces du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère se poursuit, une étude récente menée par des chercheurs de la Yale University School of Medicine publiée sur le serveur de pré-impression bioRxiv * en octobre 2020, rapporte l'effet inhibiteur du médicament merofloxacine sur le décalage du cadre pendant la réplication du SRAS-CoV-2. Il s'agit d'une preuve de concept importante qui soutient le potentiel de ciblage de -1 PRF en tant que traitement antiviral efficace dans cette pandémie ainsi que contre d'autres bêta-coronavirus.
Traduction ORF1ab et décalage de cadre
Le SRAS-CoV-2 se lie à la cellule hôte via sa protéine de pointe et commence à se répliquer afin d'établir une infection. La traduction des protéines virales commence à partir du fragment ORF1ab, qui est de loin le plus grand, mesurant plus de 21 kb de long et comprenant 2/3 de l'ensemble du génome simple brin.
Il code une polyprotéine, qui est ensuite clivée en 16 protéines non structurales (nsp) par l'action de deux protéases. De nombreuses protéines de la seconde moitié de la polyprotéine jouent un rôle essentiel dans la transcription et la réplication virales. Cela comprend nsp12, une ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp), l'ARN hélicase (Hel / nsp13) et une exoribonucléase de relecture, entre autres.
La traduction de ORF1b, le côté 3 'de ORF1ab, nécessite un décalage de cadre pour se produire dans tous les coronavirus. Lorsque les ribosomes atteignent la fin de l'ORF1a, certains d'entre eux doivent se déplacer dans la direction rétrograde d'un nucléotide. Il s'agit du décalage de cadre ribosomal programmé -1 (-1 PRF).
Suite à ce décalage, ils continuent à traduire le reste de l'ORF dans le nouveau cadre de lecture -1 jusqu'à ce que toute la grande polyprotéine ait été traduite. Sinon, ils arriveront bientôt à un codon d'arrêt dans la trame 0, ce qui mettra fin prématurément à la traduction. Cela désactivera la réplication virale.
Un écran à haut débit identifie les modulateurs PRF SARS-CoV-2 -1.
Structures FSE
On trouve souvent que la région -1 PRF contient une séquence glissante de 7 nucléotides (UUUAAAC dans SARS-CoV-2) et une structure secondaire stable en aval qui fonctionne comme un élément stimulant le décalage de cadre (FSE). Ce dernier provoque de brèves pauses dans le mouvement en avant du ribosome, ce qui laisse le temps aux ARNt d'atteindre l'alignement correct par rapport à la séquence glissante. Ceci est en partie requis pour le -1 décalage de cadre ribosomal programmé (PRF).
Un FSE commun est le pseudoknot ARN. Dans le SRAS-CoV, le SARS-CoV-2 et d'autres bétacoronavirus, on pense qu'un pseudoknot à trois souches peut peut-être agir comme le FSE. Cette structure n'est pas très courante dans les ARNm de l'hôte. Il est donc souvent utilisé pour tester l'effet de perturber explicitement l'expression des gènes viraux, comme par des mutations et des médicaments qui inhibent -1 PRF.
Cela a été démontré lors de la réplication du VIH, à la fois par un inhibiteur du PRF -1 exogène et par des indices indiquant qu'il fait partie de la réponse antivirale de l'hôte.
La mérofloxacine inhibe la réplication du SRAS-CoV-2
Dans la présente étude, les chercheurs ont identifié l'antibiotique fluoroquinolone mérofloxacine par criblage à haut débit de -1 inhibiteurs PRF du SRAS-CoV-2. Ils montrent que l'incubation avec ce composé a supprimé la réplication du SARS-CoV-2 dans les cellules Vero.
Bien que l'ivermectine soit également un inhibiteur -1 du PRF, elle a des effets de cytotoxicité, contrairement à la mérofloxacine, qui n'a que des effets cytostatiques modestes même à des niveaux élevés. Il s'agit d'un inhibiteur spécifique du bêtacoronavirus -1 PRF, contrairement aux autres fluoroquinolones qui n'ont pas cette activité. Cela suggère que les groupes structuraux à certains sites spécifiques peuvent être responsables de l'inhibition du décalage de cadre.
Étant donné que le FSE de la séquence du SRAS-CoV est presque identique à celui du SRAS-CoV-2, la mérofloxacine inhibe le décalage de 1-frame dans les deux presque également. La concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) est d'environ 20 μM, ce qui est supérieur à l'inhibition de 25% produite par un autre inhibiteur appelé SHFL.
La mérafloxacine est un inhibiteur spécifique des FSE de bétacoronavirus, mais pas d'autres coronavirus ou d'autres virus courants. D'autres coronavirus saisonniers ont une structure de pseudoknot plus élaborée, contrairement au pseudoknot à 3 souches des bétacoronavirus.
L'inhibition de la mérofloxacine résiste aux mutations d'échappement
Les chercheurs ont également découvert que l'inhibition du décalage de cadre induite par la merofloxacine persiste malgré des mutations dans le génome viral. Les virus à ARN sont connus pour avoir un taux de mutation rapide, dont certains peuvent rendre le virus résistant à l'agent antiviral. L'étude comprenait des mutations déjà connues pour exister dans le virus.
Ils ont trouvé très peu de mutations dans la séquence FSE, ce qui est prévisible compte tenu de la grande importance de -1 PRF pour la réplication virale. Parmi 20 mutations dans cette région, pas moins de 16 se sont produites une seule fois. Sur les quatre autres, deux sont dans la tige 1, et un chacun dans la tige 2 et 3.
Étant sur la tige, aucun de ceux-ci ne pourrait entraîner une altération de la structure à trois tiges du pseudoknot. Cependant, les chercheurs ont constaté que l'inhibition de -1 PRF par la merofloxacine s'est produite avec toutes ces variantes sans perte d'efficacité.
Partant de ces mutations déjà existantes qui n'ont pas changé la structure du pseudoknot, ils ont ensuite exploré l'effet d'autres mutations qui perturbaient la structure. Ils ont constaté que ceux-ci entraînaient une réduction du décalage de cadre de 10% à 77%, en fonction de leur perturbation. L'une des réductions les plus significatives a été causée par une mutation dans l'uridine unique non appariée, indiquant qu'elle a une fonction inconnue. Cette mutation, U13485, et la G13486 suivante sont complètement conservées parmi les coronavirus humains.
Bien que ces mutations génèrent un large éventail de perturbations structurelles, l'inhibition du décalage de cadre produit par la merofloxacine agissant sur toutes ces variantes est restée presque la même. Cela indique que cette action persiste et qu'il est peu probable que des mutations d'échappement émergent.
L'inhibition du décalage du cadre empêche la réplication du SARS-CoV-2
Les chercheurs ont ensuite examiné l'effet de l'inhibiteur sur la réplication virale. Ils ont constaté que la mérofloxacine inhibait la réplication à partir de la concentration la plus basse de 1,25 μM, à laquelle la concentration efficace à mi-hauteur (CE50) était de 2,6 μM. Lorsque la concentration du médicament était élevée à 40 μM ou plus, le virus devenait indétectable. La baisse du rendement viral était presque exponentiellement liée à l'inhibition du -1 PRF. Cela indique que le taux de réplication du virus dépend de l'efficacité du décalage de cadre.
Implications et orientations futures
Les FSE des coronavirus sont très efficaces, et cette étude explore la mesure à laquelle cet attribut se rapporte à la viabilité virale en utilisant un inhibiteur de décalage de cadre nouvellement identifié. Les chercheurs décrivent les résultats: « La relation quasi exponentielle entre le titre viral et l'efficacité de -1 PRF pointe vers un modèle simple dans lequel la traduction ORF1b définit la limite du taux de croissance du SRAS-CoV-2. «
Cela justifie le développement d'inhibiteurs de -1 PRF pour antagoniser efficacement la croissance du SARS-CoV-2 et d'autres virus à ARN du même type de PRF. Des recherches supplémentaires restent à mener pour élucider le mécanisme d'inhibition du -1 PRF par la mérofloxacine.
Autres explications possibles
Les résultats pourraient également être expliqués par le besoin absolu de PRF hautement efficace pour obtenir la bonne corrélation stoechiométrique entre les enzymes complexes de réplication. La perte de cet équilibre en réduisant ou en augmentant l'efficacité de -1 PRF, ne serait-ce qu'un petit peu, affecte gravement la croissance virale.
Une autre possibilité est que les petites réductions de chacune des enzymes de limitation de vitesse traduites du complexe réplicase-transcriptase s'accumulent pour provoquer une réduction marquée de la réplication virale.
Cela pourrait être dû à la liaison directe du FSE, perturbant la stabilité du pseudoknot et diminuant ainsi la pause nécessaire du ribosome qui est nécessaire pour le décalage de cadre. Un autre point de vue est que cette liaison confère une stabilité supplémentaire au pseudoknot de sorte que les ribosomes qui arrivent sont coincés trop longtemps, se heurtent ou doivent faire la queue, tout ce qui perturbe le processus d'élongation par translation en douceur.
D'autres possibilités incluent la stabilisation d'une conformation FSE incorrecte, qui empêche le décalage de cadre. De telles structures ont été récemment mises en évidence dans des cellules infectées par le virus. Si la merofloxacine interagit avec une ou plusieurs de ces structures improductives, cela pourrait réduire l'efficacité du FSE par la fraction plus petite résultante d'ARN productifs.
Enfin, la mérofloxacine peut agir sur les facteurs modulateurs de l'hôte qui agissent sur le décalage de cadre inverse, tels que les hélicases ARN de l'hôte, qui pourraient participer au pseudoknot se dépliant après le -1 PRF mais avant la poursuite de la traduction. Les fluoroquinolones sont connues pour cibler les ADN topoisomérases bactériennes. Une étude plus approfondie révélera les enzymes analogues dans les organismes supérieurs, y compris les analogues d'ARN.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
