Méthode sans bactéries pour fabriquer des clones infectieux du SRAS-CoV-2

En utilisant une réaction en chaîne par polymérase circulaire, les chercheurs ont mis au point une méthode pour fabriquer le virus recombinant du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère, avec la capacité d'introduire des mutations. Les recherches des scientifiques japonais sont publiées sur le serveur de pré-impression bioRxiv* en septembre 2020.

Alors que la pandémie COVID-19 continue d'infecter de plus en plus de personnes, il est impératif de comprendre les mécanismes par lesquels le virus SARS-CoV-2 provoque la maladie COVID-19, infecte et se réplique dans les cellules hôtes. Pour mieux comprendre comment la maladie se développe, il est nécessaire de disposer d'un système de génétique inverse simple pour le virus.

De tels systèmes sont généralement fabriqués en utilisant des clones infectieux contenant l'ADNc viral entier. Cependant, l'ADNc des coronavirus n'est pas disponible car les génomes viraux sont volumineux. Au lieu de cela, les chromosomes artificiels bactériens (BAC) ou des fragments d'ADNc sont réunis in vitro.

Mais ces systèmes ont leurs inconvénients. Dans les systèmes BAC, il peut y avoir des mutations indésirables causées par l'amplification bactérienne, ce qui nécessite alors de vérifier l'ensemble du génome à chaque fois, un processus qui prend du temps. La réunion de fragments d'ADNc est un processus complexe nécessitant une expertise.

Une autre méthode utilise la réaction en chaîne par polymérase circulaire (CPER), pour générer des clones infectieux de flavivirus. Les fragments d'ADNc et un fragment de liaison sont amplifiés par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Les fragments amplifiés sont conçus pour inclure des extrémités se chevauchant avec d'autres fragments, et peuvent donc être étendus sous la forme d'un génome viral circulaire. Ce génome viral est ensuite introduit dans les cellules appropriées, et les clones viraux infectieux sont récupérés.

Mise en place d'une génétique inverse basée sur le CPER pour le SRAS-CoV-2. (A) Représentation schématique d'une approche CPER pour la génération de SARS-CoV-2 recombinant. Un total de 9 fragments (F1 à F8 et F9 / 10) couvrant toute la longueur du génome du SARS-CoV-2 ont été amplifiés, puis assemblés avec un fragment de liaison UTR comprenant le HDVr, le signal BGH polyA et le promoteur CMV par CPER. Les produits CPER résultants ont été transfectés dans les cellules sensibles. (B) Les cellules HEK293-3P6C33 ont été transfectées avec le produit CPER et l'image en fond clair a été acquise 7 jours après la transfection (dpt) (à gauche). En tant que contrôle négatif, le produit CPER obtenu sans fragment F9 / 10 a été transfecté dans des cellules et l'image en fond clair a été obtenue à 7 dpt (à droite). (C) Marqueurs génétiques (2 mutations silencieuses, A7,486T et T7,489A) dans le génome recombinant du SRAS-CoV-2. (D) Comparaison de la cinétique de croissance du SRAS-CoV-2 recombinant généré par CPER avec celle de l'isolat d'origine. Les cellules VeroE6 / TMPRSS2 ont été infectées par les virus (MOI = 0,001 ou 0,01), et les titres infectieux dans les surnageants de culture des cellules infectées par le SRAS-CoV-2 ont été déterminés par test TCID50 de 12 à 48 heures après l'infection (hpi) . (E) Analyses par transfert de Northern des ARN sous-génomiques. Les ARN extraits de cellules infectées par le virus parental et le SRAS-CoV-2 recombinant récupéré par CPER ont été soumis à des analyses de Northern blot.

Mise en place d'une génétique inverse basée sur le CPER pour le SRAS-CoV-2. (A) Représentation schématique d'une approche CPER pour la génération de SARS-CoV-2 recombinant. Un total de 9 fragments (F1 à F8 et F9 / 10) couvrant toute la longueur du génome du SARS-CoV-2 ont été amplifiés, puis assemblés avec un fragment de liaison UTR comprenant le HDVr, le signal BGH polyA et le promoteur CMV par CPER. Les produits CPER résultants ont été transfectés dans les cellules sensibles. (B) Les cellules HEK293-3P6C33 ont été transfectées avec le produit CPER et l'image en champ clair a été acquise 7 jours après la transfection (dpt) (à gauche). En tant que contrôle négatif, le produit CPER obtenu sans fragment F9 / 10 a été transfecté dans des cellules et l'image en fond clair a été obtenue à 7 dpt (à droite). (C) Marqueurs génétiques (2 mutations silencieuses, A7,486T et T7,489A) dans le génome recombinant du SRAS-CoV-2. (D) Comparaison de la cinétique de croissance du SARS-CoV-2 recombinant généré par CPER avec celle de l'isolat d'origine. Les cellules VeroE6 / TMPRSS2 ont été infectées par les virus (MOI = 0,001 ou 0,01), et les titres infectieux dans les surnageants de culture des cellules infectées par le SRAS-CoV-2 ont été déterminés par test TCID50 de 12 à 48 heures après l'infection (hpi) . (E) analyses de transfert de Northern des ARN sous-génomiques. Les ARN extraits de cellules infectées par le virus parental et le SRAS-CoV-2 recombinant récupéré par CPER ont été soumis à des analyses de Northern blot.

CPER pour SARS-CoV-2

Dans une nouvelle étude, une équipe de chercheurs a utilisé l'approche CPER pour générer des clones infectieux pour le SRAS-CoV-2.

Premièrement, pour tester si l'approche CPER pouvait être utilisée pour le SRAS-CoV-2, les chercheurs ont utilisé 10 fragments de gène viral, qui couvraient l'ensemble du génome viral, un fragment de liaison, ainsi qu'un promoteur pour cloner dans un plasmide. Ensuite, ils ont utilisé 10 fragments d'ADNc des fragments de gène viral, connectés les 9e et 10e fragments par PCR, et effectué CPER, lorsque l'ADNc de pleine longueur a été obtenu par clone.

Pour vérifier si les produits obtenus étaient viables, ils ont infecté les cellules avec ces produits et ont étudié les cellules pour les changements dus à l'infection virale. Ils ont trouvé des gènes viraux recombinants formés après 7 jours de transfection dans les cellules, mais seulement dans un type de cellules, HEK293-3P6C33. Ceci suggère que l'efficacité de transfection des produits CPER et l'efficacité de réplication du virus sont importantes pour former un virus recombinant.

Les auteurs ont effectué un séquençage génétique des virus formés par la méthode CPER, qui a montré qu'il n'y avait pas de contamination du virus, et il a maintenu les marqueurs génétiques. Ils n'ont trouvé qu'une seule différence dans les marqueurs génétiques du virus P0, montrant que le système de génétique inverse pour le SRAS-CoV-2 avait une grande précision.

Après avoir testé plusieurs ensembles d'amorces, les auteurs ont découvert que la conception des amorces est importante pour un assemblage efficace du génome circulaire. Par conséquent, «une enquête plus approfondie sur les conditions du CPER (c'est-à-dire les séquences de promoteur et les ensembles d'amorces) pour SARS-CoV-2 peut améliorer la récupération des recombinants», écrivent les auteurs.

Les chercheurs ont également étudié la cinétique du virus recombinant par rapport au virus SARS-CoV-2 parent. Ils ont constaté que la propagation du virus recombinant était plus lente que celle du virus parent, mais atteignait des niveaux similaires à ceux du virus parent.

L'analyse par transfert Northern a montré huit ARN sous-génomiques, à la fois dans le virus recombinant et le virus parent. Ainsi, les caractéristiques biologiques du virus formé par la méthode CPER sont similaires à celles du virus parent.

Ajout de mutations

Les chercheurs ont testé la méthode CPER pour ajouter des gènes rapporteurs au virus recombinant. Ils ont remplacé une séquence de nucléotides dans le génome viral par le gène sfGFP.

Après analyse de séquence après CPER et test de fluorescence GFP après expression de la protéine fluorescente dans les cellules, ils ont trouvé que le virus recombinant avait la mutation ajoutée. Cependant, le taux de croissance du virus muté était plus lent que celui du parent.

Cependant, lorsque les chercheurs ont utilisé NanoBiT, un rapporteur divisé ayant deux sous-unités, NanoBiT de haute affinité (HiBiT) et grand NanoBiT (LgBiT), la cinétique de croissance était similaire à celle du virus de type sauvage.

Dans leur test, ils ont inséré le gène de la luciférase HiBiT et une séquence de liaison dans le virus SARS-CoV-2 par PCR, puis ont utilisé CPER pour générer le SARS-CoV-2 recombinant avec HiBiT. Des études antérieures ont montré que le gène HiBiT peut être utile pour les expériences animales et le dépistage de médicaments.

En outre, les auteurs ont également montré qu'ils pouvaient insérer une mutation dans la protéine de pointe du virus, qui a été observée en Europe et dans les Amériques, sans aucun changement dans la cinétique de croissance du virus recombinant.

Ainsi, les auteurs disent que la méthode CPER peut être un outil rapide et simple pour développer des vaccins vivants atténués sûrs et caractériser des mutations dans le virus lors de l'utilisation de vaccins ou de médicaments.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.

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