Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) qui est à l’origine de la pandémie actuelle de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), a fait l’objet d’un examen et de recherches approfondis au cours des 14 derniers mois. La compréhension de sa caractérisation est essentielle pour le développement d’antiviraux, de vaccins ou d’anticorps thérapeutiques efficaces.
Un nouveau pré-imprimé publié sur le bioRxiv* Le serveur fournit la preuve directe que les oligosaccharides attachés à la protéine de pointe de surface virale sont essentiels pour l’infection virale, offrant de nouvelles approches aux médicaments préventifs et thérapeutiques.
Sommaire
Rôle du pic de SRAS-CoV-2
Le virus se fixe et pénètre dans la cellule hôte via sa protéine de pointe. Cette fixation implique le domaine de liaison au récepteur (RBD) sur la protéine de pointe, et le récepteur de la cellule hôte, l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2).
Le pic et le récepteur sont glycosylés, le premier étant beaucoup plus lourd, avec jusqu’à 22 N-glycanes par protomère. On pense que les rôles joués par ces sucres incluent le repliement correct des protéines et la transformation conformationnelle, l’attachement au récepteur et le masquage d’épitope pour éviter la neutralisation des anticorps.
Des études antérieures ont utilisé des pseudovirus exprimant le pic de SRAS-CoV-2 pour comprendre le rôle de cette protéine. Des mutations au niveau des sites de N-glycosylation ont montré que l’absence de ces sucres au niveau de certains résidus clés de la RBD réduit considérablement l’infectivité. Le knock-out du gène N-glycosylant MGAT1 a également réduit la capacité d’un pseudovirus à accomplir l’invasion de la cellule hôte. Cependant, de vrais clones d’ADNc de SRAS-CoV-2 n’ont pas encore été utilisés pour étudier cet aspect.
N-glycosylation du pic
La N-glycosylation est la principale modification post-traductionnelle se produisant dans les cellules eucaryotes. Il commence dans la membrane du réticulum endoplasmique (ER), le site d’assemblage de la molécule qui agit comme le précurseur universel de tous les N-glycanes, à savoir, lc3Man9GlcNAc2-dolichol-P. Dans une série d’étapes, le glycane est ajouté à une chaîne peptidique en croissance via l’enzyme STT3, modifié par les α-glucosidases I et II dans le RE, et ainsi exporté vers l’appareil de Golgi.
Après édition par les α-mannosidases, et d’autres changements structurels pour devenir un glycane complexe ou hybride, il devient un glycane mature, la structure exacte dépendant du type de cellule et de l’espèce.
Plusieurs petits inhibiteurs ont été découverts qui peuvent agir contre les enzymes tout au long de la voie. Certains sont déjà utilisés pour traiter le diabète ou la maladie de Gauche de type I, tandis que d’autres sont testés dans des essais cliniques pour une activité antivirale à large spectre.
Dans l’étude actuelle, l’utilisation d’inhibiteurs chimiques ou enzymatiques ou de knock-out génétique, pour perturber la N-glycosylation et l’effet sur l’infection in vitro a été examiné.
Inhibition chimique
Les chercheurs ont d’abord utilisé dix inhibiteurs agissant le long de la voie de N-glycosylation. Ils ont découvert que ces composés prévenaient principalement l’infection par le SRAS-CoV-2 lorsqu’ils étaient ajoutés à la culture cellulaire avant, pendant ou jusqu’à six heures après la provocation virale. Cependant, cela n’était pas dû à une toxicité cellulaire directe, mais à l’incapacité de la cellule hôte à glycosyler les particules virales.
L’effet variait entre les inhibiteurs, les plus efficaces étant ceux qui agissaient aux premières étapes de la voie. Ceux-ci ont réduit l’infection de 92 à 98% dans deux types de cellules, Vero et HEK (dérivées respectivement de cellules épithéliales de singe vert africain et de rein humain). L’inhibition de l’a-mannosidase I n’a pas réussi à prévenir l’infection dans l’un ou l’autre type de cellule avec un effet significatif.
Gene knockdown
Les chercheurs ont utilisé des siRNA pour abattre les gènes codant pour les enzymes clés de glycosylation avant d’infecter les cellules avec le SRAS-CoV-2. Trois knock-down ont été réalisés pour l’enzyme STT3, la sous-unité ER a-glucosidase I GANAB et l’enzyme MGAT1. Le premier renversement a réduit l’infection dans les deux types de cellules de plus de 50%.
Cependant, lorsque différentes isoformes STT3 ont été éliminées séparément, des résultats variables ont été observés dans les cellules Vero et HEK. Avec STT3-A et STT3-B, il y avait une inhibition sévère de l’infection dans les cellules HEK et Vero, respectivement. Le knockdown du GANAB a réduit les infections dans les deux types de cellules, mais dans une moindre mesure, à environ 40% par rapport à ~ 50% avec les inhibiteurs de STT3. Enfin, le knockdown MGAT1 a montré un effet protecteur uniquement dans les cellules HEK, réduisant l’infection de 40%.
Effets de la non-glycosylation
Le nombre de nouveaux virions et la proportion de cellules infectées ont été réduits de près de 400 fois après le traitement par NGI-1 par rapport aux témoins. L’ARN viral total n’était que 80 fois inférieur, ce qui signifie que l’altération ou l’élimination des N-glycanes sur les protéines virales a conduit à la production de virions non infectieux.
Cela a été confirmé en utilisant la Peptide-N-Glycosidase F (PNGase-F), un composé qui élimine tous les N-glycanes des glycoprotéines. Les cellules traitées avec ce composé sont restées non infectées, prouvant que les virus du SRAS-CoV-2 avec des protéines non glycosylées n’étaient pas infectieux.
Les chercheurs postulent que la perturbation de la N-glycosylation empêche une infection réussie par le SRAS-CoV-2 en interférant avec le repliement ou la fonction des protéines virales; abolition du potentiel infectieux par les virions nouvellement formés; ou une inadéquation des récepteurs ACE2 qui ne sont pas correctement repliés.
L’inhibition précoce la plus efficace
Une inhibition précoce de la voie s’est avérée être la plus efficace, en empêchant la formation du précurseur universel ou son addition au polypeptide viral nouvellement formé. Lorsque le renversement STT3 comprenait les deux isoformes, une protection efficace se produisait dans les deux lignées cellulaires.
Une perturbation ultérieure de la voie par l’inhibition de l’ER a-glucoside I a montré une réduction moindre mais toujours significative de l’infectivité. Il y avait également une différence significative dans l’inhibition obtenue par différents inhibiteurs. Les iminosucres Miglustat, Celgosivir et NN-DNJ ont été les plus efficaces pour réduire la charge virale, le nombre de cellules infectées et le nombre de cellules présentant un effet cytopathique.
Les chercheurs attribuent ces variations d’efficacité à des différences dans les profils de N-glycosylation entre la cellule hôte et les virions répliqués.
Suppression de la production de virions infectieux
Deuxièmement, alors que les cultures témoins ont montré des cellules infectées formant des grappes, suggérant une propagation virale entre les cellules, les cultures traitées ont montré des cellules infectées en tant qu’entités discrètes. Cela peut indiquer qu’un assemblage incorrect du virion ou un échec de la libération du virion, supprimant leur capacité à infecter les cellules adjacentes. En fait, le nombre de cellules infectées dans les échantillons traités suit toujours la dose initiale de virus inoculé, tandis que chez les témoins, les cellules présentent une infection progressivement croissante.
Les cellules à N-glycosylation inhibée pourraient ainsi être incapables de produire des virions glycosylés et donc infectieux, mettant fin à l’infection. En fait, le traitement des cellules infectées avec une dose sous-inhibitrice de NGI-1 a réduit le nombre de virions infectieux par rapport aux cellules non traitées, même si la quantité de matériel génétique dans les deux types de culture était similaire.
L’ablation génétique des gènes de N-glycosylation de l’hôte réduit l’infectivité du SARS-CoV-2. (a) Analyses de puits entiers représentatives de monocouches Vero E6 confluentes transfectées avec siNT (contrôle négatif) ou siRNA pour le knockdown des gènes de N-glycosylation siSTT3-A, siSTT3-B, siSTT3A + B, siGANAB et siMGAT1, et infectées avec SARS-CoV-2 (MOI = 0,05, 24 heures). Cellules immunocolorées avec des anticorps anti-spike (vert), contre-colorées avec DAPI (violet) et fusionnées; barre d’échelle 5 mm. (b) Images représentatives de cellules siARN soit Vero E6 ou HEK293ACE-2 242 infectées par SARS-CoV-2 (MOI = 0,05 pendant 24 heures pour Vero; MOI = 0,1 pendant 24 heures pour HEK293). Cellules immunisées avec anti-pic (canal gris) et fusionnées (vert) avec un contre-colorant DAPI (bleu); barres d’échelle 200 µm. (c) Quantification du pourcentage de cellules infectées (spike-positives) dans « a » normalisées aux témoins siNT de cellules Vero E6 ou HEK293ACE-2 infectées par le SRAS-CoV-2 (MOI = 0,05, 24 heures pour Vero; MOI = 0,1 pendant 24 heures pour HEK293). Les barres indiquent les valeurs moyennes; les points indiquent les valeurs individuelles, les barres d’erreur représentent l’écart type; les astérisques indiquent la signification (p <0,001); trois répétitions techniques, quatre expériences indépendantes effectuées. (d) Western blot de lysats protéiques de cellules Vero comparant des cellules témoins siNT avec des cellules siSTT3-A, siSTT3-B, siGANAB ou siMGAT1 sondant avec des anticorps spécifiques contre la protéine renversée, et avec anti-GAPDH comme contrôle de chargement; marqueurs de poids moléculaire apparent annotés à gauche.
Quelles sont les implications?
L’étude a démontré que l’inhibition de la voie de N-glycosylation à des points importants a conduit à une réduction significative de l’infection par le SRAS-CoV-2 et de la réplication en culture cellulaire, en utilisant des cellules Vero et HEK. Dans la plupart des cas, l’utilisation de l’inhibiteur a conduit à moins de cellules infectées, moins de cellules présentant l’effet cytopathique viral et une charge virale réduite dans ces cellules. Les études de renversement de gènes ont confirmé ces résultats.
Les inhibiteurs les plus efficaces préviennent l’infection lorsqu’ils sont ajoutés avant, pendant ou après l’infection. Le manque ou la réduction des N-glycanes empêche l’infection réplicative par le SRAS-CoV-2.
Les cellules traitées par un inhibiteur produisaient une population significative de virions incapables d’infecter d’autres cellules hôtes, contrairement aux cellules non traitées qui produisaient uniquement des virions infectieux. »
Ceci a été confirmé en éliminant les N-glycanes de la surface des virions intacts, conduisant à une perte complète d’infectivité. Cela indique le rôle essentiel joué par les N-glycanes de surface dans l’infection par le SRAS-CoV-2.
Les preuves générées dans cette étude ouvrent la porte à d’autres recherches sur le développement de moyens d’exploiter l’inhibition de la N-glycosylation et les glycanes du SRAS-CoV-2 N pour traiter le COVID-19.
De telles thérapies peuvent être moins vulnérables aux mutations car elles ciblent une voie protéique plus conservée.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.