Alors que le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) continue de provoquer des cas de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) dans le monde entier, la détection précoce des cas est une priorité élevée pour minimiser la transmission du virus pendant la période présymptomatique. phase. Un nouveau document de recherche intéressant sur la pré-impression qui a été publié sur le bioRxiv * serveur décrit récemment l’utilisation d’anticorps monoclonaux rigides (mAbs) par opposition aux mAb flexibles, et comment cela affecte la liaison de plusieurs mAbs au même antigène.
Limitations de NP
La protéine nucléocapside (NP) du SRAS-CoV-2 est essentielle pour l’incorporation de l’ARN génomique viral dans de nouvelles particules virales. Leur synthèse se produit au sein des complexes de réplication-transcription formés au sein de la cellule hôte, site de réplication de l’ARN. La protéine N est produite en abondance et déclenche une réaction immunitaire robuste. Cependant, la plupart des tests ciblent l’antigène de pointe, citant une plus faible réactivité croisée entre les anticorps et une corrélation plus élevée avec la capacité de neutralisation.
Un test de NP réussi pourrait rendre le diagnostic beaucoup plus simple. Les tests sérologiques ne peuvent pas être utilisés avant 7 à 10 jours après l’infection, période minimale de séroconversion. La détection basée sur l’antigène est la méthode la plus sensible pour le diagnostic de l’infection par le SRAS-CoV-2. De plus, ce type de test est bien adapté aux dosages à flux latéral (LFA) au point de service.
L’appariement linéaire ou sandwich des MAbs dépend de la flexibilité inhérente. A) Chromatogrammes SEC-MALS-SAXS pour les échantillons mAb1-2-NPNTD (vert), mAb2-4-NPNTD (rouge) et mAb1-4-NPNTD (gris). Les lignes pleines représentent le signal UV 280 nm en unités arbitraires, tandis que les symboles représentent la masse moléculaire (en haut) calculée à partir des valeurs MALS et Rg (en bas) pour chaque trame SAXS collectée en fonction du temps d’élution. B) Fonctions P (r) calculées pour les courbes SAXS expérimentales pour le pic SEC principal de mAb1-2-NPNTD (vert), mAb2-4-NPNTD (rouge), mAb1-4-NPNTD (gris) et épaule SEC précoce de mAb1-2-NPNTD (points verts). Les fonctions P (r) sont normalisées au r = 40Å. Les pics P (r) -maxima sont indiqués. Les graphiques expérimentaux SAXS et Guinier sont présentés dans la figure supplémentaire 1. C) Enveloppe SAXS moyenne obtenue pour mAb2-4-NPNTD, le complexe mAb1-2-NPNTD a été calculé en utilisant l’opérateur de symétrie P2.
Potentiel des LFA
Les LFA ne sont pas aussi sensibles que la réaction en chaîne transcriptase-polymérase inverse, mais c’est un domaine sur lequel on travaille activement. Pour ces tests, l’antigène NP a un avantage distinct dans son abondance et sa structure. Le NP est une phosphoprotéine à deux domaines et un linker Arg-Ser. La protéine existe sous forme de dimère à travers le domaine C-terminal (CTD).
En présence d’ARN, le domaine N-terminal et le CTD du NP forment un seul site d’interaction. Cela constitue la base sur laquelle la nucléocapside est construite. La détection de NP est possible jusqu’à un jour avant l’apparition des symptômes, et des tests de fluorescence LFA sont actuellement disponibles pour la détection du SRAS-CoV-2 NP dans les échantillons nasopharyngés et nasaux sur écouvillon.
Les méthodes de test LFA pourraient exploiter l’agglutination des antigènes, médiée par des anticorps. Plus la valence antigénique est élevée, plus la formation du complexe antigène-anticorps est importante. L’agglutination se produit également avec des mAb appariés qui se lient à des épitopes séparés sur l’antigène. Les LFA basés sur ce phénomène ont conduit à une meilleure sensibilité et spécificité, abaissant la limite de détection de ces tests pour NP.
Rigidité des anticorps et arrangement complexe
La flexibilité des anticorps est un paramètre important dans la reconnaissance des mAb, et donc dans les performances du LFA. Dans l’étude actuelle, les chercheurs ont utilisé des méthodes biophysiques pour caractériser les Acm ciblant les ATN du NP à partir d’un pool de neuf anticorps anti-NP commerciaux. Ceci a été utilisé pour corréler la flexibilité de l’anticorps avec la superstructure formée suite à la liaison des mAbs au NTD du NP.
Les chercheurs ont utilisé plusieurs techniques, y compris la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) couplée à la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et à la diffusion de la lumière multi-angles (SEC-MALS-SAXS), pour identifier les mAbs qui se lient sélectivement au NP-NTD. Ils ont couplé ces découvertes avec des modèles atomiques de mAbs afin de visualiser la structure des complexes multi-anticorps, en particulier la conformation du Fc aux fragments Fab.
La rigidité se traduit par une disposition linéaire
Ils ont effectué des simulations de dynamique moléculaire (MD) sur la région charnière Fc à des températures extrêmes afin que la chaleur empêche les Fab d’être piégés. Ils ont découvert qu’il était simple de différencier les paires de mAbs qui se lient à différents épitopes de la NP-NTD de celles qui sont simplement en compétition pour le même site de liaison. Ils ont réalisé que mAb1 et mAb4 appartiennent à cette dernière catégorie, tandis que mAb1 ou mAb4 peuvent être mélangés avec mAb2 pour former des espèces de masses plus élevées, indiquant qu’ils se lient à différents epitopes.
Ils ont trouvé une stoechiométrie et une orientation différentes pour chaque paire de mAb, ainsi que des masses différentes. Par exemple, le complexe mAb1-mAb2 de 380 kDa a une orientation différente entre les paires par rapport au complexe mAb2-mAb4 de 340 kDa, avec un arrangement linéaire par rapport à un arrangement en sandwich qui est creux au centre. Le «sandwich» correspond à l’enveloppe et est composé de deux antigènes liés par deux Fab, un de chaque côté. La paire linéaire mAb1-mAb2 partage une seule NTD.
Les chercheurs attribuent cette différence d’orientation aux variations de la flexibilité des mAbs. Dans la paire mAb2-mAb4, les deux sont flexibles, ce qui fait que les mAb sont fermés et coiffés autour des deux antigènes. Le Fab plus rigide de mAb2 est ainsi capable d’inclure deux NTD de deux NP, en raison du mAb4 très flexible. Puisque mAb1 a également un Fab rigide, il ne peut pas se lier avec le NP-NTD sur le mAb2, ce qui rend la conformation du complexe linéaire.
La linéarité permet la polymérisation
L’agencement linéaire de ce complexe permet à de nombreux mAbs de former un réseau à travers les épitopes laissés à découvert sur les NTD attachés aux régions les plus externes des Fab. Le complexe résultant peut devenir très grand, peut-être parce que la conformation linéaire est étendue. Ainsi, l’agglutination est influencée par la flexibilité du mAb.
La différence de résultat fonctionnel ne peut pas être attribuée à des différences d’affinité, car la cinétique de tous les anticorps s’est avérée comparable à des niveaux picomolaires.
Signal plus élevé du complexe mAb linéaire
Les chercheurs ont également découvert que la sensibilité de détection pour le complexe mAb linéaire pourrait être augmentée par une modification du protocole conventionnel de test d’immunosorbant lié à une enzyme (ELISA), les mAb de détection étant ajoutés aux antigènes de test pendant la période d’incubation et de pic de mAb2 libre. dans les mAbs de détection avant cet ajout. Cela devait permettre une polymérisation maximale de l’anticorps, le pic conduisant plus tard à la formation d’un réseau étendu de l’arrangement linéaire. Une telle polymérisation ne peut pas se produire avec l’agencement en sandwich. La LOD a été abaissée, en conséquence, de deux fois, à des concentrations d’antigène élevées.
Cette amélioration structurellement dérivée de la sensibilité était maintenue même lorsqu’un détergent était ajouté, perturbant ainsi le virion. En fait, la présence du détergent Triton-X-100 a augmenté la LOD en dessous de 0,4 pg / ml.
Quelles sont les implications?
Alors que la FDA américaine a récemment approuvé un test LFA en vente libre pour une utilisation à domicile dans la détection des antigènes du SRAS-CoV-2N, la LOD de ces tests doit être augmentée. La plupart de ces tests utilisent des dosages colorimétriques à base de mAb, améliorés par des nanoparticules luminescentes, des dosages immunologiques fluorescents ou des billes magnétiques. Contrairement à la PCR, cependant, le signal n’est pas amplifié lorsque l’antigène de test est détecté par la sonde.
Deuxièmement, de tels tests utilisent la liaison antigène-anticorps à un rapport de 1: 1, mais l’augmentation du rapport des anticorps de détection aux anticorps de capture augmentera également le rapport du signal à l’antigène, et améliorera ainsi sa détection. C’est là que l’étude actuelle aide en fournissant une méthode rapide pour identifier d’abord les paires de mAb qui se lient linéairement à l’antigène, ce qui augmente la sensibilité de détection. Cette approche est simple d’utilisation et permet d’étudier les interactions anticorps en solutions, où elles sont plus dynamiques par rapport à leur étude en cristaux ou en grilles.
Les observateurs ont également constaté que la flexibilité des mAb peut affecter de plus grands assemblages de mAb même sans antigènes supplémentaires. La tendance de nombreux Acm à s’agréger a mis fin prématurément à de nombreux processus de développement. Cependant, l’approche actuelle peut séparer rapidement ces agrégats de mAbs uniques, reliant ainsi la structure à l’agrégation. Il peut également différencier les mAbs flexibles et rigides en solution. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre dans quelle mesure la glycosylation affecte la flexibilité.
La polymérisation du mAb-mAb4 vue ici serait rejetée comme agrégation dans d’autres techniques mais est ici exploitée pour amplifier le signal après la détection d’antigène d’une manière dépendante de la concentration d’antigène.
Une optimisation supplémentaire est possible, sans ajouter de facteurs externes, en utilisant la rigidité inhérente des mAbs. En utilisant cette approche, des centaines de mAbs peuvent être criblés pour trouver le plus rigide, puis le LFA LOD réduit par de telles méthodes d’optimisation pour développer un dispositif au point de service avec une sensibilité élevée pour la détection du SARS-CoV-2 ainsi que d’autres futurs agents pathogènes.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
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