Dans un récent medRxiv * preprint paper, des chercheurs du centre de santé de l’Université du Connecticut aux États-Unis dévoilent leur méthode numérique CRISPR à démarrage à chaud (WS-CRISPR) pour la détection quantitative rigoureuse et sensible du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) en échantillons cliniques de patients atteints de maladie à coronavirus (COVID-19).
Étant donné qu’un traitement antiviral efficace et des vaccins COVID-19 entièrement validés sont jusqu’à présent indisponibles dans notre bataille contre le COVID-19, une quantification précise et précise du virus SRAS-CoV-2 joue un rôle central dans l’évaluation des paramètres d’infectivité et le contrôle de la pandémie en cours.
Afin de quantifier le SARS-CoV-2, la réaction en chaîne par transcription inverse-polymérase basée sur une sonde (RT-PCR) est actuellement utilisée comme technique de référence en raison de sa sensibilité et de sa spécificité relativement élevées; néanmoins, cela dépend d’instruments coûteux et de sondes bien conçues qui ne conviennent pas aux petites cliniques ou aux environnements de santé communautaire.
De même, les méthodes d’amplification isotherme sont en fait destinées à des fins de détection qualitative ou sont fréquemment exposées à une amplification non spécifique indésirable ou à des signaux faux positifs.
C’est là que la détection d’acide nucléique basée sur CRISPR-Cas entre en jeu. Néanmoins, la question est de savoir si elle peut être modifiée pour permettre une quantification précise sans amplification prématurée indésirable de la cible et surestimation ultérieure si la détection numérique est utilisée.
Un groupe de recherche des États-Unis, dirigé par le Dr Xiong Ding du Département de génie biomédical de l’Université du Connecticut Health Center à Farmington, a décrit un test numérique WS-CRISPR qui promet une quantification valide et fiable du SARS-CoV-2 nucléique. acides dans les échantillons cliniques.
Vue d’ensemble du test numérique WS-CRISPR. a, Le mélange réactionnel WS-CRISPR à un pot est d’abord préparé dans un tube. Après distribution dans la puce numérique QuantStudio 3D, plus de dix mille microréactions sub-nanolitre (~ 0,7 nL) sont isolées dans des micropuits. Lorsqu’elle est incubée à 52 ° C, chaque microréaction avec une cible ARN SARS-CoV-2 entreprend une réaction WS-CRISPR et génère une forte fluorescence verte (points positifs), alors que pas dans ceux sans cible (points négatifs). La barre d’échelle est de 300 μm. Grâce à la détection et au comptage des microréactions positives (ou spots), l’ARN du SRAS-CoV-2 peut être quantifié en fonction de la proportion de spots positifs. b, principe de fonctionnement du test WS-CRISPR à un pot pour la détection du SARS-CoV-2. Le mélange réactionnel WSCRISPR contient un complexe Cas12a-crRNA, six amorces DAMP (deux amorces externes de FO et RO, deux amorces internes de FI et RI, et deux amorces de compétition de FC et RC), un rapporteur ssDNA-FQ, une transcriptase inverse SuperScript IV, ADN polymérase de Bst et ARN de SARS-CoV-2 dans un format en un seul pot.
Éléments de base de la nouvelle méthode
Dans cette entreprise scientifique passionnante, les chercheurs ont profité d’une première réaction CRISPR à démarrage à chaud en un seul pot, qui combine une amplification isotherme à double amorçage à transcription inverse à basse température (RT-DAMP) et une détection basée sur CRISPR-Cas12a.
Plus spécifiquement, pour coupler ces deux systèmes de réaction différents en un seul pot, de la pyrophosphatase a été ajoutée pour maintenir une concentration constante d’ions magnésium en dégradant le sous-produit de pyrophosphate de magnésium.
En outre, des amorces internes phosphorothioées ont été utilisées pour permettre une amplification isotherme de transcription inverse efficace à des températures plutôt basses (telles que 52 ° C) dans cette étude.
Enfin, en partitionnant le mélange réactionnel à un pot en microréactions sub-nanolitre à l’aide de puces numériques QuantStudio 3D, ce groupe de recherche a développé un test CRISPR numérique qui permet une quantification sensible et fiable du SARS-CoV-2.
Déplacer l’objectif des diagnostics CRISPR
Par rapport aux techniques d’acide nucléique basées sur CRISPR précédemment rapportées, ce test numérique WS-CRISPR offre plusieurs avantages exceptionnels. Il s’agit avant tout d’une démonstration inaugurale d’un test CRISPR à un pot qui combine Bacillus stearothermophilus (Bst) Amplification isotherme par transcription inverse basée sur l’ADN polymérase avec détection CRISPR-Cas12a – sans avoir besoin d’une température de réaction plus élevée et d’acides nucléiques plus longs.
En outre, la méthode est généralement lancée à une température élevée (supérieure à 50 ° C), abordant le problème de l’amplification prématurée indésirable de la cible dans la détection numérique, ainsi que l’affichage d’une sensibilité 10 fois plus élevée et d’une spécificité de détection élevée par rapport au volume à base de tube. format de test.
En ciblant le gène nucléoprotéique de SARS-CoV-2, il est possible de quantifier aussi bas que 5 copies d’ARN de SARS-CoV-2 par microlitre dans la puce avec l’utilisation du test numérique WS-CRISPR. De plus, la quantification peut avoir lieu dans des échantillons cliniques, ce qui permet d’évaluer l’infectivité du COVID-19 et l’efficacité des médicaments antiviraux.
Enfin, le test numérique WS-CRISPR proposé affiche un niveau de tolérance élevé aux inhibiteurs et peut être utilisé pour détecter directement le virus dans des échantillons de salive brute, évitant ainsi le besoin d’extraction d’ARN. Cela facilitera à son tour le diagnostic du COVID-19 et réduira le risque d’infection chez les agents de santé.
Un aperçu du futur
«En tant que premier test CRISPR numérique validé cliniquement, notre test numérique WS-CRISPR fournit une détection quantitative fiable, sensible et simple du SRAS-CoV-2», soulignent les chercheurs de l’étude dans ce medRxiv papier de pré-impression. «Cela ouvre une nouvelle exploration de la détection quantitative d’acide nucléique à base CRISPR», ajoutent-ils.
Détection directe du SRAS-CoV-2 dans des échantillons de salive brute par dosage WS-CRISPR numérique. a, Flux de travail pour le test direct du SARS-CoV-2 dans des échantillons de salive enrichis par un test numérique WS-CRISPR. b, Micrographies de fluorescence de point final de la puce pour la détection directe du virus SRAS-CoV-2 enrichi dans des échantillons de salive. Échantillons de salive 1-5, les échantillons contenant 10%, 5%, 2,5%, 1% et 0% de virus SARS-CoV-2 inactivé par la chaleur. Chaque micrographie est un représentant de six régions distinctes prises pour couvrir environ 2809 microréactions. PC, échantillon de contrôle positif pour le SARS-CoV-2. NC, échantillon de contrôle SARS-CoV-2-négatif. NTC, contrôle sans modèle. Les barres d’échelle mesurent 300 μm.
Nonobstant les avantages ci-dessus, une nouvelle puce numérique doit être explorée plus avant et validée pour le test numérique WS-CRISPR à l’avenir, avec la nécessité d’étapes de validation clinique supplémentaires.
En outre, bien que ce test numérique WS-CRISPR utilise une microscopie à fluorescence relativement coûteuse à des fins d’imagerie, la microscopie à fluorescence portable basée sur un smartphone peut devenir une option alternative pour la détection quantitative sur site dans un proche avenir.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.
