La protéine SARS-CoV-2 N forme des condensats biomoléculaires avec de l'ARN viral

La pandémie de COVID-19 causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est devenue une menace grave pour la santé mondiale. La recherche montre que le virus SARS-CoV-2 se propage en conditionnant son génome d'ARN dans des enceintes membranaires de cellules hôtes. Bien que l'on sache que l'empilement de l'ARN viral dans le virion naissant est médié par la protéine de nucléocapside (N), le mécanisme sous-jacent de ceci n'est pas clair.

Maintenant, une étude menée par des chercheurs de l'Université de Californie à Berkeley et de l'Université de Californie à San Francisco a montré que la protéine N forme des condensats biomoléculaires avec l'ARN viral dans des études in vitro et in vivo. La recherche intitulée «La protéine de nucléocapside du SRAS CoV-2 forme des condensats avec l’ARN génomique viral» a été publiée sur le serveur de pré-impression bioRxiv* le 14 septembreth, 2020.

La majorité des méthodes développées jusqu'à présent pour traiter le COVID-19 ciblent les interactions entre la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 et le récepteur ACE2 humain et, par conséquent, le stade initial de l'infection dans les cellules hôtes. Peu d'études se concentrent sur l'arrêt de la prolifération du virus dans les cellules hôtes après l'infection.

Afin de se propager dans les cellules hôtes, le génome viral se réplique d'abord, et l'ARN génomique, lié par la protéine virale N, est ensuite exporté vers le cytosol à l'aide d'un complexe de pores moléculaires. L'ARN viral et la protéine N forment des complexes de ribonucléoprotéines virales (vRNP), des structures asymétriques de «billes sur une chaîne» qui se lient à la protéine de la membrane virale (M). Cela déclenche le bourgeonnement du complexe vRNP et la libération du virus enveloppé dans l'espace extracellulaire.

La protéine SARS-CoV-2 N

Selon certaines études antérieures, l'organisation des domaines de la protéine SARS-CoV N et son interaction avec des structures à phases séparées montrent que la phase de la protéine N se sépare du génome viral dans les cellules hôtes infectées.

La protéine N présente plusieurs des caractéristiques des systèmes de séparation de phase, notamment un domaine de liaison à l'ARN (RBD), une distribution de charge électrostatique inégale, des régions intrinsèquement désordonnées et un domaine de dimérisation. La protéine N a également un motif riche en sérine / arginine (SR), qui aide à la séparation de phase dans d'autres ribonucléoprotéines, et un domaine de type prion qui peut déclencher le démixtion des protéines.

La séparation de phase de la protéine N peut former des compartiments sans membrane qui conduisent l'empaquetage du génome viral dans les cellules hôtes. La séparation de phase crée des organites sans membrane tels que le nucléole, l'hétérochromatine, le centrosome, les granules de stress et les granules P.

L'étude et ses conclusions

Dans cette étude, l'équipe de chercheurs a exprimé la protéine N du virus SRAS-CoV-2 dans des cellules de rein embryonnaire humain (HEK 293) pour voir si elle pouvait former un condensat biomoléculaire avec de l'ARN génomique viral in vitro. Ils ont observé que la protéine N et l'ARN génomique formaient des structures similaires au modèle de «billes sur une chaîne» observé dans les cellules hôtes infectées.

Modèle de remodelage du génome de l'ARN viral par la protéine SARS CoV-2 N. (A) La protéine N conditionne l'ARN génomique viral dans des structures asymétriques de type gel par séparation de phase. Le nilotinib empêche la formation de structures d'ordre supérieur par la protéine N et peut perturber l'encapsidation du génome de l'ARN dans l'enveloppe virale. (B) les vRNPs interagissent avec les protéines membranaires virales à la surface du compartiment intermédiaire ER-Golgi et forment le virus enveloppé.

Modèle de remodelage du génome de l'ARN viral par la protéine SARS CoV-2 N. (A) La protéine N conditionne l'ARN génomique viral dans des structures asymétriques de type gel par séparation de phase. Le nilotinib empêche la formation de structures d'ordre supérieur par la protéine N et peut perturber l'encapsidation du génome de l'ARN dans l'enveloppe virale. (B) les vRNPs interagissent avec les protéines membranaires virales à la surface du compartiment intermédiaire ER-Golgi et forment le virus enveloppé.

À l'aide de la spectrométrie de masse réticulée, l'équipe a pu identifier 2 régions flanquant le domaine de dimérisation. Ils ont constaté que l'élimination de la séquence d'oligomérisation C-terminale perturbait complètement la séparation de phase.

«Nous avons observé que l'ARN et l'ARN viral forment des structures d'ordre supérieur qui ressemblent au modèle de« perles sur une chaîne »observé dans les cellules infectées», explique l'équipe.

Le motif SR hautement phosphorylé dans les cellules humaines favorise les interactions des protéines hôtes, la transcription du génome viral et le ciblage nucléaire. Bien que les rapports précédents suggèrent que la phosphorylation SR rend les condensats N plus liquides dans le SRAS-CoV-2, cette étude n'a trouvé aucune preuve du motif SR entraînant la séparation de phase de la protéine SARS-CoV-2 N dans les cellules humaines.

En testant une bibliothèque de molécules approuvées par la FDA, les chercheurs ont identifié des médicaments capables de manipuler la taille, la forme ou le nombre de gouttelettes de protéines N. Un inhibiteur particulier de la kinase, le nilotinib, a montré une capacité prometteuse à perturber la condensation in vitro de la protéine N avec l'ARN viral.

Interactions entre les protéines N et entre N et G3BP1. (A) Dans une expérience qualitative initiale, des interactions par paires ont été détectées par CLMS à 300 mM de sel. Les lignes représentent une réticulation unique détectée. Les régions des interactions des protéines N flanquent le domaine de dimérisation. (B) Graphique du volcan des données quantitatives CLMS comparant la gouttelette et aucune condition de gouttelette. Les points de données opaques ont une valeur p inférieure à 0,05, les points de données transparents ont une valeur p supérieure à 0,05. Le vert représente des réticulations uniques qui sont enrichies à l'état de gouttelettes. Les marqueurs jaunes représentent les réticulations K169-K65 et K169 (phosS176) - K65. (C) La structure du domaine de dimérisation (pdb # 2JW8 (64)). Du fait que les extrémités N et C des protomères sont éloignées l'une de l'autre, il est peu probable que R1 et R2 dans le même dimère interagissent l'un avec l'autre. (D) La spectrométrie de masse a identifié que le domaine de liaison à l'ARN de la protéine de granule de stress G3BP1 interagit avec la région R2 de N.

Interactions entre les protéines N et entre N et G3BP1. (A) Dans une expérience qualitative initiale, des interactions par paires ont été détectées par CLMS à 300 mM de sel. Les lignes représentent une réticulation unique détectée. Les régions des interactions des protéines N flanquent le domaine de dimérisation. (B) Graphique du volcan des données quantitatives CLMS comparant la gouttelette et aucune condition de gouttelette. Les points de données opaques ont une valeur p inférieure à 0,05, les points de données transparents ont une valeur p supérieure à 0,05. Le vert représente des réticulations uniques qui sont enrichies à l'état de gouttelettes. Les marqueurs jaunes représentent les réticulations K169-K65 et K169 (phosS176) – K65. (C) La structure du domaine de dimérisation (pdb # 2JW8 (64)). Du fait que les extrémités N et C des protomères sont éloignées l'une de l'autre, R1 et R2 dans le même dimère sont peu susceptibles d'interagir l'un avec l'autre. (D) La spectrométrie de masse a identifié que le domaine de liaison à l'ARN de la protéine de granule de stress G3BP1 interagit avec la région R2 de N.

Comment les résultats pourraient-ils aider à combattre le COVID-19?

En exprimant la protéine N dans un système mammifère in vitro, l'étude a montré que la protéine N forme des condensats liquides avec des fragments d'ARN non structurés et peut également former un condensat biomoléculaire avec de l'ARN viral, ce qui était conforme aux études précédentes.

Grâce au rôle fondamental de la protéine N dans l'empaquetage du génome viral, les chercheurs pensent qu'elle pourrait être une cible potentielle des médicaments utilisés pour traiter le COVID 19. Cette étude fournit des informations précieuses sur la façon dont les médicaments existants utilisés dans la gestion du COVID-19 modulent l'infection virale. Un médicament spécifique identifié par l'équipe, le nilotinib, a eu un impact sur la séparation de phase avec un ARN viral spécifique et un ARN Poly-C non spécifique in vitro.

Bien que des études antérieures aient suggéré que le nilotinib puisse inhiber la propagation du SRAS-CoV et du SARS-CoV-2, le mécanisme d'inhibition n'était pas clair. Les résultats de cette étude ont clairement indiqué que le nilotinib inhibe la formation de condensat N / ARN, ce qui pourrait perturber la réplication virale.

«Nos résultats indiquent que le nilotinib affecte la formation des condensats N / ARN, ce qui pourrait potentiellement nuire à la réplication virale.», Explique l'équipe

Ces résultats indiquent la nécessité de mener davantage d'études de ce type axées sur le rôle du nilotinib dans le traitement
Patients COVID-19. De nombreux essais cliniques sur le COVID-19 impliquant le médicament parent du nilotinib, l'imatinib, sont actuellement en cours.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.

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