La phosphorylation de la protéine N du SRAS-CoV-2 affecte sa fonction

La pandémie actuelle de COVID-19 est causée par un nouveau coronavirus appelé coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2). Le SRAS-CoV-2 fait partie d'une famille de virus enveloppés avec un grand génome à ARN simple brin. L'acide nucléique est compacté dans une structure indistincte appelée nucléocapside, constituée de protéine N. Maintenant, une nouvelle étude par des chercheurs de l'Université de Californie à San Francisco et publiée sur le serveur de préimpression bioRxiv * en juin 2020 montre l'effet de la phosphorylation sur l'état et la fonction de la protéine N.

Lorsque le SRAS-CoV-2 pénètre dans une cellule hôte, il est désassemblé, la nucléocapside se brise et permet au génome d'être traduit en plusieurs protéines non structurelles, y compris l'ARN polymérase dépendante de l'ARN. Ces protéines réorganisent les membranes complexes du réticulum endoplasmique de la cellule hôte pour former le complexe de transcription de réplication (RTC). Le RTC est un cadre sur lequel les protéines virales de réplication et de transcription sont disposées, et peut-être cachées de la réponse immunitaire innée de l'hôte.

La réplication du génome viral commence lorsque le brin d'ARN est utilisé comme matrice pour produire un brin complémentaire dans les régions sous-génomiques qui codent pour quatre protéines structurales majeures, S, M, N et E, nécessaires à l'assemblage viral. Le mécanisme de la transcription sous-génomique implique l'achèvement des gènes codant pour les protéines structurelles une par une, chaque transcription génique se terminant lorsque la polymérase saute les régions intermédiaires vers une séquence de régulation de la transcription (TRS) à l'extrémité 5 '. Il en résulte la formation de fragments sous-génomiques.

Ces fragments sont soumis à une transcription, pour produire les gènes viraux originaux. Ceux-ci peuvent être traduits pour produire les protéines structurelles nécessaires pour réassembler le virus.

Phosphorylation des protéines N nécessaire à la transcription virale

Les protéines sous-génomiques les plus abondantes codent pour la protéine N, et sa traduction se déroule à des niveaux élevés au début de l'infection. Il s'avère donc s'empiler en grappes au RTC et peut être déterminant pour provoquer les réarrangements structurels dans l'ARN qui sont nécessaires à la transcription sous-génomique.

La protéine N se trouve presque sous la même forme parmi tous les coronavirus et possède deux domaines globulaires, les domaines N-terminal et C-terminal (respectivement NTD et CTD). Autour de celles-ci se trouvent des régions intrinsèquement désordonnées. La protéine N est dimérique, et la structure a de multiples sites auxquels l'ARN se lie, y compris une rainure de liaison à l'ARN importante formée par deux CTD étroitement liés et un autre sur le NTD. Dans certaines conditions, ces structures forment des oligomères en se liant entre différentes régions de la protéine.

Dans la région désordonnée, il existe une séquence avec une abondante sérine-arginine (SR) qui est considérée comme essentielle pour la régulation de la fonction des protéines N. Au début de l'infection, celle-ci subit une phosphorylation rapide sur de nombreux sites, médiée par des kinases cytoplasmiques. Cela facilite la transcription sous-génomique dans le RTC. À mesure que l'infection progresse, la synthèse des nucléocapsides et l'assemblage viral deviennent indépendants de la phosphorylation des protéines N.

La présente étude vise à comprendre comment la protéine N est influencée par la phosphorylation.

Caractérisation des condensats de protéines N. a, analyse SDS-PAGE de tous les mutants de la protéine N utilisés dans cette étude, colorés au bleu de Coomassie. La protéine b, N a été incubée à la température indiquée pendant 30 min en présence d'ARN 1 5M-400. Barre d'échelle, 10 µm. La protéine c, N a été incubée avec 1 uM de 5’-400 pendant 16 h à température ambiante. Barre d'échelle, 10 µm. d, des condensats de 10 uM de protéine WT ou 10D N ont été formés dans un tampon de gouttelettes (70 mM de KCl) par incubation avec 1 uM d'ARN PS-318 pendant 30 min et imagés. Du NaCl a ensuite été ajouté à une concentration finale de 250 mM pendant 15 min avant d'imagerie à nouveau.

Caractérisation des condensats de protéines N. une analyse SDS-PAGE de tous les mutants de la protéine N utilisés dans cette étude, colorés au bleu de Coomassie. La protéine b, N a été incubée à la température indiquée pendant 30 min en présence d'ARN 1 5M-400. Barre d'échelle, 10 µm. La protéine c, N a été incubée avec 1 uM de 5’-400 pendant 16 h à température ambiante. Barre d'échelle, 10 µm. d, des condensats de 10 uM de protéine WT ou 10D N ont été formés dans un tampon de gouttelettes (70 mM de KCl) par incubation avec 1 uM d'ARN PS-318 pendant 30 min et imagés. Du NaCl a ensuite été ajouté à une concentration finale de 250 mM pendant 15 min avant d'imagerie à nouveau.

L'oligomérisation de la protéine N nécessite de l'ARN

Dans certaines conditions, la protéine N forme des oligomères. Cela semble être des gouttelettes liquides, mais afin d'éliminer la possibilité de contamination par l'ARN, les chercheurs ont retiré l'ARN. Ils ont ensuite trouvé peu de structures protéiques microscopiques mais amélioré la formation de structures protéiques une fois l'ARN ajouté. Les nouvelles structures ressemblaient étroitement aux formes natives. En d'autres termes, l'ARN est nécessaire pour la formation d'oligomères d'ordre supérieur.

Avec l'ajout d'ARN à température ambiante et à une concentration de 10 μM, la protéine N a formé des réseaux de petites « billes de type liquide » en présence d'ARN sous-génomique. À mesure que la concentration en protéine N augmentait, le diamètre des gouttelettes augmentait à plusieurs microns. L'ARN témoin, cependant, a provoqué la formation d'amas de brins amorphes, qui n'étaient que partiellement liquides.

Lorsque la concentration d'ARN était faible, de petites structures sphériques se sont formées, mais à des concentrations d'ARN plus élevées, des filaments se sont formés. Lorsque les concentrations d'ARN et de protéines N étaient presque égales, aucune structure n'a été générée. Les chercheurs concluent: « Ces résultats suggèrent que les condensats dépendent de la réticulation de plusieurs protéines N par un seul ARN. »

Ensuite, ils ont découvert que lorsqu'ils ajoutaient un segment TRS d'ARN 10 nucléotides de long, des gouttelettes se formaient rapidement. Avec des segments d'ARN plus longs, des filaments se sont formés à la place, pour générer une structure de type gel.

À différentes concentrations de protéine N-TRS, la formation de gouttelettes a montré un changement marqué, passant de quelques gouttelettes à une concentration élevée de N à une formation abondante à de faibles niveaux de protéine N.

Cela indique qu'en l'absence d'ARN long, la protéine N inhibe la formation d'oligomères liés au TRS. En d'autres termes, la liaison à la protéine TRS-N monovalente produit un changement dans la structure de la protéine N. Le nombre accru d'interactions protéine-protéine de faible affinité provoque la formation de gouttelettes. Cependant, lorsque de longs ARN sont présents, comme dans des conditions physiologiques, la liaison de la protéine ARN-N multivalente améliore la formation de gouttelettes.

Caractérisation des condensats de protéines N. a, Images du mutant de la protéine N 10D après une incubation de 30 minutes avec les ARN indiqués. Barre d'échelle, 10 µm. b, 10 uM de protéine de type sauvage (WT) ou 10D N a été incubée avec 1 uM d'ARN 5’-400 pendant 10 min. Nsp3 Ubl1-GFP a ensuite été ajouté à une concentration de 1 uM et incubé pendant 15 minutes supplémentaires avant l'imagerie en fond clair (à gauche) ou en fluorescence (à droite). c, moyennes de classe 2D de particules provenant de l'analyse EM de la protéine N de type sauvage et de l'ARN PS-318 montrés sur la figure 4c.

Caractérisation des condensats de protéines N. a, Images du mutant de la protéine N 10D après une incubation de 30 minutes avec les ARN indiqués. Barre d'échelle, 10 µm. b, 10 uM de protéine de type sauvage (WT) ou 10D N a été incubée avec 1 uM d'ARN 5’-400 pendant 10 min. Nsp3 Ubl1-GFP a ensuite été ajouté à une concentration de 1 uM et incubé pendant 15 minutes supplémentaires avant l'imagerie en fond clair (à gauche) ou en fluorescence (à droite). c, moyennes de classe 2D de particules provenant de l'analyse EM de la protéine N de type sauvage et de l'ARN PS-318 montrés sur la figure 4c.

La phosphorylation modifie la forme du condensat de protéine N

Des variations expérimentales similaires ont montré que la protéine N et l'ARN viral travaillent ensemble pour s'assembler en une variété de structures en fonction des forces intramoléculaires et intermoléculaires très différentes à l'œuvre.

La protéine N non modifiée est un condensat filamenteux de type gel, montrant une structure partiellement ordonnée. En effet, les filaments sont plus rigides et se forment probablement après des interactions à forte avidité, telles que la liaison multivalent ARN-protéine et protéine-protéine. La présence de longues séquences d'ARN augmente les interactions protéine-protéine car elles peuvent se lier aux nombreux sites de liaison d'ARN sur la protéine.

Les résultats semblent également indiquer que lorsque la région SR du génome est phosphorylée, les condensats changent pour devenir plus liquides. La liaison protéine-ARN et protéine-protéine via cette région est bloquée, ainsi que la liaison intramoléculaire avec l'ARN sur d'autres sites. Cette perte d'affinité qui en résulterait donnerait lieu à une gouttelette plus liquide.

Deux fonctions, deux formes

Les oligomères de la protéine N de phosphorylation existent donc sous différentes formes, qui sont requises pour ses deux fonctions principales de conditionnement d'ARN compact et de transcription sous-génomique. Avec la première, la protéine N forme un cadre structurel. Cela permet l'assemblage de la nucléocapside, qui peut reposer sur une base de gouttelettes uniformes de protéines et d'ARN.

Dans ce dernier but, les attributs de type liquide des gouttelettes de protéines N phosphorylées pourraient être vitaux au RTC. La protéine N subit une phosphorylation complète dès qu'elle est synthétisée et forme rapidement une structure en association avec de grandes structures membranaires supposées former le RTC.

La phosphorylation de la protéine N est nécessaire pour sa fonction de régulation sous-génomique au RTC. En rassemblant toutes ces données, les chercheurs affirment que leurs résultats suggèrent la formation d'un compartiment protecteur pour les composants de réplication et de transcription virale, formé par une matrice de protéine N phosphorylée de type liquide avec de l'ARN qui y est lié de manière lâche et liée aux membranes du RTC par nsp3.

Les inhibiteurs tels que les petites molécules qui inhibent la GSK-3 kinase, une enzyme clé de la phosphorylation, empêchent le traitement normal des génomes du virus de l'hépatite de souris (MHV) et entraînent une baisse de la production de virions dans les cellules infectées par ces virus. Ils pourraient peut-être jouer un rôle dans la prévention de la progression de l'infection précoce au COVID-19.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.

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