Une étude récente publiée sur le serveur de pré-impression bioRxiv * en octobre 2020 montre que la liaison du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) au récepteur de l'hôte humain pourrait provoquer la séparation de la protéine de pointe trimérique typique, formant un monomère stable à la place avec le récepteur. Cela pourrait indiquer le potentiel d'utilisation de l'enzyme de conversion de l'angiotensine soluble recombinante 2 (ACE2) pour traiter l'infection.
En utilisant la microscopie électronique cryogénique (Cryo-EM), il est possible d'étudier la structure de macromolécules biologiques, en particulier de protéines de haut poids moléculaire sans avoir à les cristalliser au préalable.
Le SRAS-CoV est un coronavirus et a donc une enveloppe lipidique parsemée de nombreuses glycoprotéines de pointe. Chacun de ceux-ci a deux sous-unités, S1 et S2. La protéine de pointe forme normalement des assemblages trimères et assure la médiation de la liaison virale au récepteur de l'hôte humain, l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2), suivie d'une entrée virale dans la cellule.
Une analyse de particules uniques a été réalisée pour le SARS-CoV-2, en utilisant la cryo-EM. Cela montre une structure en forme de champignon, avec un pont de fusion virale entre le virus et la cellule hôte formé par la protéine de pointe virale et l'ectodomaine de la protéine du récepteur ACE2, la partie qui se projette au-delà de la membrane de la cellule hôte.
Sommaire
ACE2 présente sa cible pharmaceutique
Des études antérieures ont révélé que les domaines de liaison au récepteur Spike (RBD) du SARS-CoV et du SARS-CoV-2 ont des affinités de liaison comparables pour l'ectodomaine ACE2 à de faibles niveaux nanomolaires. Cependant, par rapport aux coronavirus antérieurs, le nouveau SARS-CoV-2 montre une plus grande adhérence des cellules hôtes et permet une entrée virale plus efficace.
Les chercheurs ont étudié la structure des virions du SRAS-CoV-2 inactivés de type sauvage par cryo-tomographie électronique. Cela a montré qu'une fois que la sous-unité de pointe virale S2 fusionne avec la membrane de la cellule hôte, les trimères S2 post-fusion sont dispersés sur la surface du virion.
La liaison Spike-ACE2 provoque un réarrangement
L'ectodomaine de la protéine de pointe a été exprimée sous forme de préfusion en culture cellulaire et a montré la forme trimérique typique, avec la microscopie électronique à transmission (TEM) montrant des particules en forme de champignon comme prévu. L'ectodomaine ACE2 humain a également été exprimé dans une autre lignée cellulaire et incubé avec la protéine de pointe.
Ils ont effectué une TEM sur des échantillons du mélange spike-ACE2 et ont constaté que les particules étaient de forme très différente des trimères de pointe classiques. Les particules étaient pour la plupart plus petites que les trimères de pointe non complexés, avec une asymétrie significative.
Modèles proposés pour la formation du complexe Spike-hACE2 et le réarrangement structurel. La rangée supérieure montre une voie possible menant à un changement conformationnel du pic de SARS-CoV2 trimérique. Dans ce modèle, une molécule hACE2 se lie à un monomère Spike S1 et induit les changements conformationnels dans le Spike trimérique. Par la suite, un trimère S2 post-fusion est formé. La rangée inférieure montre une nouvelle voie proposée menant au démontage du trimère de Spike par hACE2. En présence d'une concentration élevée de molécules hACE2, un complexe Spike-hACE2 (3: 3) se forme. Les affrontements structurels entre les trois éléments Spike-hACE2 conduisent à leur dissociation. Cela induit la formation de complexes monomères Spike-hACE2.
Les chercheurs ont conclu que les trimères de pointe se dissociaient après avoir été incubés avec les particules hACE2 pendant une période prolongée. Cela concorde avec les résultats récents d'autres études.
La variation de la taille des particules les a conduits à purifier encore davantage le complexe, en utilisant la chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Ils ont trouvé trois tailles de particules différentes dans ce mélange. Le premier pic contenait un pic agrégé et hACE2, tandis que le pic 3 contenait plus d'hACE2 libre. Le pic 2 était homogène et contenait le pic hACE2 complexé.
Ceci a été examiné plus en détail par cryoEM, qui a montré la présence d'une protéine de pointe monomère liée à hACE2. Cela montre que la liaison à hACE2 provoque la dissociation de l'homotrimère de pointe. Le domaine C-terminal (CTD) et le domaine N-terminal (NTD) de la protéine S1 ont subi un réarrangement significatif de leurs structures par rapport au monomère de pointe dans la conformation «ascendante» du pic.
Cela concorde avec les structures précédemment rapportées du complexe RBD-ACE2.
Avec une période d'incubation plus courte, les chercheurs ont découvert qu'il y avait un petit groupe de particules qui correspondait au trimère de pointe de préfusion. Le complexe s'est avéré être composé d'un mélange de pointe et hACE2 dans un rapport molaire de 3: 3, tous les RBD étant dans la conformation « vers le haut '' et quelque peu incliné de l'axe central du trimère, comme précédemment observé par d'autres chercheurs.
Comparaison structurelle des complexes Spike-hACE2
Le réarrangement structurel des modèles monomères et trimériques du complexe spike-hACE2 montre que le CTD et le NTD sont décalés d'environ 30o –afin de permettre au monomère protéique S1 de se lier à hACE2. À ce stade, les hACE2 et les RBD sont en accord avec les structures cristallines rapportées précédemment. Il existe de nombreux sites d'encombrement stérique au niveau du CTD du S1 et de la région voisine de l'unité S2 dans le modèle ancré du modèle trimérique S1-hACE2.
Alors que le rapport exact dans lequel le pic s'attache à l'hACE2 pour l'entrée virale dans la cellule hôte n'est pas encore clair, il semble que la liaison d'un hACE2 par un trimère de pointe initie la liaison et l'initialisation de la fusion virale avec la cellule hôte avant l'activation infection. La structure trimère S2 post-fusion a également été analysée récemment, mais la confusion entoure toujours le processus par lequel la fusion membranaire est accomplie après la libération du complexe S1-hACE2.
L'étude actuelle montre qu'un complexe stable peut être formé à partir d'un monomère S1 avec le hACE2, tandis que le cryo-EM n'a montré aucune preuve de fragments S1 isolés autres que dans les complexes équimolaires Spike-hACE2 mentionnés ci-dessus. Cela peut indiquer la stabilité du complexe S1-hACE2 dans les conditions expérimentales.
Aucun des complexes monomères pic-hACE2 ne contenait de sous-unités S2, bien qu'il ait été détecté dans l'échantillon. L'interface S1-S2 est censée être via un domaine de boucle d'interface court hébergeant un site de clivage de furine protéase. L'absence de trimères stables pourrait augmenter la flexibilité de cette boucle et ainsi rendre le S2 invisible à la cryo-EM. Ou bien, les sous-unités S2 peuvent avoir subi une dénaturation lors de la préparation de l'échantillon.
Implications
L'étude actuelle montre l'architecture du complexe protéique spike-ACE2. Il s'agit d'un complexe contenant le monomère de pointe SI et ACE2, à la suite d'un réarrangement significatif de la structure de la protéine isolée. Ainsi, disent les chercheurs, la liaison à ACE2 fait que la protéine de pointe change sa conformation et subit ainsi un désassemblage du trimère.
Cela montre que l'ACE2 n'est pas seulement une cible médicamenteuse pour prévenir mais aussi pour traiter une infection par le SRAS-CoV-2. Si de tels agents sont développés, ils pourraient empêcher la protéine de pointe d'interagir avec d'autres molécules ACE2 sur d'autres cellules humaines, prolongeant ainsi l'infection.
Les résultats de la présente étude pourraient aider à comprendre comment le fragment S1 se désassemble du complexe après l'entrée virale, ce qui à son tour pourrait aider à mieux découvrir la pathogenèse et le mécanisme d'infection du SRAS-CoV-2.
Récemment, certains chercheurs ont montré que l'infection par le SRAS-CoV-2 peut être inhibée par un récepteur hACE2 soluble recombinant, peut-être par compétition directe pour l'hôte ACE2 pour la protéine de pointe virale. Si elle est suffisamment saturée en ACE2 soluble, la protéine de pointe peut ne pas être capable de se lier à la cellule hôte, disent-ils.
Cette explication devient difficile à saisir à la lumière des découvertes actuelles selon lesquelles hACE2 soluble provoque en fait le désassemblage de la structure de pointe trimérique et la formation d'un complexe monomère de pointe-hACE2 stable. Il est proposé de passer par les étapes suivantes:
- Formation d'un complexe 3: 3 spike-hACE2
- Le trimère à pointes devient très flexible
- La CTD et la NTD de la protéine de pointe subissent un réarrangement conformationnel lors de la liaison de la pointe à hACE2
- Le nouveau complexe S1-hACE2 ne peut pas rester sous forme trimérique en raison de nombreux obstacles stériques et forme un complexe monomère à la place par dissociation.
Cette hypothèse gagne un certain soutien dans une autre prépublication récente qui discute de la formation d'un complexe monomère en réponse à des molécules de DARPin modifiées.
Si cela est confirmé, cela montre que l'hACE2 soluble peut bloquer l'infection et la réplication du virus ainsi que déclencher la déstabilisation des complexes pointe trimère-hACE2, entravant ainsi le processus de fusion virale qui est nécessaire pour l'infection.
Les chercheurs disent: «Ce mécanisme suggère une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement du COVID-19, en ajoutant de l'hACE2 soluble pour dissocier le trimère Spike des virus en approche. »
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.