Image CryoEM saisissante du SARS-CoV-2

Le virus du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) qui cause COVID-19 est un bêtacoronavirus, avec un génome à ARN simple brin et plusieurs protéines structurelles. Parmi ceux-ci, le pic ou la protéine S qui se lie au récepteur de la cellule hôte, ACE2, est important comme antigène contre lequel les anticorps neutralisants sont dirigés. Une nouvelle étude réalisée par des chercheurs du Royaume-Uni et d'Allemagne et publiée sur le serveur de préimpression bioRxiv * en juin 2020 rapporte les résultats d'une étude détaillée de la protéine S sur le virus intact, en utilisant la microscopie cryoélectronique (cryoEM) et la tomographie. Cela pourrait aider à comprendre la conformation de la protéine S sur le virion et comment il interagit avec les anticorps neutralisants.

Structure CryoEM du virus

Sur cryoEM, le virus est une particule sphérique, d'environ 100 nm de diamètre, avec un viroplasme dense et avec une bicouche lipidique des deux côtés, sur laquelle se trouvent des pointes composées de la glycoprotéine appelée protéine S. Ceux-ci reconnaissent et se lient au récepteur ACE2 à la surface cellulaire et sont responsables de l'endocytose et de l'entrée virale ultérieure dans la cellule hôte. Ce processus implique un réarrangement structurel dramatique, avec des états conformationnels de pré-fusion et de post-fusion bien distincts.

L'infection du virus dans une cellule hôte humaine conduit à un remodelage profond de l'organisation des membranes internes de la cellule hôte. Cela conduit à la production d'organites qui permettent la réplication virale. Les protéines structurales virales sont incorporées dans le réticulum endoplasmique (ER), d'où elles sont transportées vers le compartiment intermédiaire ER Golgi (ERGIC). Le génome est ensuite enveloppé par la capside de la protéine N, ce qui entraîne la formation de particules virales qui sont ensuite transportées à la surface de la cellule et libérées.

Caractérisation de la production de virus et images représentatives de virions SARSCoV-2 intacts et authentiques. (A) Analyse Western blot de SARS-CoV-2 S et N dans les lysats de cellules VeroE6 et dans les préparations virales. Dans les virions libérés, S est présent sous des formes clivées et non clivées. (B) Quatre tranches tomographiques représentatives de virions SARS-CoV-2 du surnageant de cellules infectées. Les virions sont approximativement sphériques, contiennent une densité granulaire correspondant au génome emballé en N et ont des trimères de protéine S dépassant à des angles variables de leurs surfaces. Barre d'échelle 50 nm. (C) Trois exemples de trimères S de l'ensemble de données présentés sous forme de projections à travers le trimère pour illustrer l'inclinaison variable vers la membrane. Barre d'échelle 10 nm.

Caractérisation de la production de virus et images représentatives de virions SARSCoV-2 intacts et authentiques. (A) Analyse Western blot de SARS-CoV-2 S et N dans les lysats de cellules VeroE6 et dans les préparations virales. Dans les virions libérés, S est présent sous des formes clivées et non clivées. (B) Quatre tranches tomographiques représentatives de virions SARS-CoV-2 du surnageant de cellules infectées. Les virions sont approximativement sphériques, contiennent une densité granulaire correspondant au génome emballé en N et ont des trimères de protéine S dépassant à des angles variables de leurs surfaces. Barre d'échelle 50 nm. (C) Trois exemples de trimères S de l'ensemble de données présentés sous forme de projections à travers le trimère pour illustrer l'inclinaison variable vers la membrane. Barre d'échelle 10 nm.

Structure de pointe de préfusion

La structure de préfusion de la protéine S est généralement étudiée à l'aide de la protéine S sécrétée exprimée sur d'autres cellules, qui est ensuite purifiée puis soumise à cryoEM et à la reconstruction de particules uniques. Cela a conduit à la compréhension suivante: la protéine S de préfusion a un domaine de liaison aux récepteurs (RBD) au sommet d'une large pointe composée de trois unités protéiques de pointe, au-dessus du noyau de fusion. Les trois copies du RBD, une sur chaque protéine de pointe, se trouvent au milieu des trois domaines N-terminaux (NTD).

Lorsque la conformation de préfusion est à l'état fermé, les trois copies du RBD sont à plat sur la surface de la pointe, bloquant le site de liaison du récepteur. À l'état ouvert, un ou plusieurs des trois RBD sont exposés pour permettre au récepteur de se lier à l'ACE2.

Le trimère à pointes est glycosylé et il y a 22 sites de N-glycosylation sur chaque protomère. Lorsque l'état de préfusion cède la place à l'état de post-fusion, le peptide de fusion et le domaine transmembranaire se rejoignent à une extrémité de la longue structure en forme d'aiguille, le long de laquelle se trouvent cinq glycanes liés à N.

L'étude: des pointes in situ à la surface des cellules

L'étude actuelle a examiné les particules virales SARS-CoV-2 récupérées des cellules infectées, sans concentration ni étape de purification. Les chercheurs ont vu que les particules étaient de forme et de taille similaires à la description précédente. Les trimères S en saillie avaient deux formes. L'une était la structure mince ressemblant à la structure post-fusion en forme d'aiguille, tandis que la plupart étaient plus larges, ressemblant à la forme de préfusion. Environ 97% étaient en pré-fusion et 3% en post-fusion.

Cela concorde avec les tomogrammes des virions produits par les cellules infectées en culture, qui montrent également le même type de protéines de pointe, environ 25 par virion. Les chercheurs ont également examiné les formes minces et larges du trimère S et ont constaté qu'elles présentaient une correspondance frappante avec les états de post-fusion et de préfusion, respectivement.

Classification RBD et S Trimer

Les RBD de chacun des protomères ont été classés individuellement. Il y avait trois types de classes, les RBD fermés, les RBD ouverts et la plupart fermés mais avec une densité quelque peu affaiblie, ce qui pourrait indiquer que la conformation pourrait être plus variable. Ils ont constaté que les trimers fermés et les trimers avec un seul RBD ouvert avaient la même fréquence, environ 40% à 45%. Environ 13% avaient deux RBD ouverts. Ces résultats montrent que l'ouverture RBD est également visible sur la surface virale ainsi que dans les trimères S recombinants.

Deuxièmement, ils ont classé les trimères par orientation et ont constaté que la région de tige qui attache la pointe à la membrane agit comme une charnière, permettant à la pointe de s'incliner dans toutes les directions. Ils ont également constaté que la protéine S se trouve à une distribution d'environ 1 pour 100 nm2, ce qui suggère que l'avidité est moins importante dans la liaison aux récepteurs que pour les virus de la grippe.

Analyse structurale des trimères SARS-CoV-2 S à partir de virions intacts. (A) Structures du trimère S de préfusion (gauche) et postfusion (droite) à partir de virions intacts déterminés par la moyenne du sous-programme Les structures sont représentées sous la forme d'une isosurface grise transparente équipée de structures du trimère SARS-CoV-2 S fermé (PDB 6VXX) et du trimère SARS-CoV-1 S postfusion (PDB 6M3W). Dans la forme de préfusion, un monomère est coloré du bleu (extrémité N) au rouge (extrémité C). Le domaine N-terminal est bleu, le RBD apparaît cyan. Notez que le NTD n'occupe pas complètement la densité EM car un certain nombre de boucles ne sont pas résolues ou intégrées dans PDB 6VXX. (B) Les différentes conformations du trimère de préfusion S observées sur des virions intacts par moyenne de sous-programme. Trois conformations ont été observées: tous les RBD en position fermée (à gauche, équipés de PDB 6VXX); un RBD en position ouverte (au centre, équipé de PDB 6VYB); deux RBD en position ouverte (à droite, équipés de PDB 6X2B qui n'inclut pas les glycanes modélisés). Notez que la conformation à deux ouvertures n'a été observée in vitro qu'après insertion de multiples mutations stabilisantes. Les monomères S à RBD fermés sont verts et à RBD ouverts sont bleus. (C) La moyenne des sous-ensembles de trimères regroupés selon leur orientation par rapport à la membrane montre une flexibilité dans la région de la tige. Des exemples sont présentés pour des piscines centrées à 0 °, 25 ° et 50 ° de la perpendiculaire, et pour deux rotations différentes du trimère par rapport à la direction d'inclinaison. (D) Modèles 3D de deux virions SARS-CoV-2 individuels avec une membrane (bleue) du rayon mesuré, et toutes les protéines de pointe montrées dans les conformations, positions et orientations déterminées par la moyenne du sous-programme.

Analyse structurale des trimères SARS-CoV-2 S à partir de virions intacts. (A) Structures du trimère S de pré-fusion (à gauche) et de post-fusion (à droite) à partir de virions intacts déterminés par la moyenne du sous-programme. Les structures sont représentées sous la forme d'une isosurface grise transparente équipée de structures du trimère SARS-CoV-2 S fermé (PDB 6VXX) et du trimère SARS-CoV-1 S postfusion (PDB 6M3W). Dans la forme de préfusion, un monomère est coloré du bleu (extrémité N) au rouge (extrémité C). Le domaine N-terminal est bleu, le RBD apparaît cyan. Notez que le NTD n'occupe pas complètement la densité EM car un certain nombre de boucles ne sont pas résolues ou intégrées dans PDB 6VXX. (B) Les différentes conformations du trimère de préfusion S observées sur des virions intacts par moyenne de sous-programme. Trois conformations ont été observées: tous les RBD en position fermée (à gauche, équipés de PDB 6VXX); un RBD en position ouverte (au centre, équipé de PDB 6VYB); deux RBD en position ouverte (à droite, équipés de PDB 6X2B qui n'inclut pas les glycanes modélisés). Notez que la conformation à deux ouvertures n'a été observée in vitro qu'après insertion de multiples mutations stabilisantes. Les monomères S à RBD fermés sont verts et à RBD ouverts sont bleus. (C) La moyenne des sous-ensembles de trimères regroupés selon leur orientation par rapport à la membrane montre une flexibilité dans la région de la tige. Des exemples sont présentés pour des piscines centrées à 0 °, 25 ° et 50 ° de la perpendiculaire, et pour deux rotations différentes du trimère par rapport à la direction d'inclinaison. (D) Modèles 3D de deux virions SARS-CoV-2 individuels avec une membrane (bleue) du rayon mesuré, et toutes les protéines de pointe montrées dans les conformations, positions et orientations déterminées par la moyenne du sous-programme.

Implications de l'étude

Notamment, les chercheurs ont constaté qu'après concentration, les images cryoEM montraient des trimères S uniquement dans la conformation fermée, à la fois avant et après la fusion, contrairement à d'autres études qui suggèrent que le RBD ouvert dans le trimère de protéine S soluble se trouve dans de nombreuses positions différentes .

Tranches centrales à travers des virus représentatifs. Les virions des cellules Calu-3 avaient une distribution de diamètre légèrement plus large que ceux des cellules VeroE6. Barre d'échelle 50 nm.

Tranches centrales à travers des virus représentatifs. Les virions des cellules Calu-3 avaient une distribution de diamètre légèrement plus large que ceux des cellules VeroE6. Barre d'échelle 50 nm.

Cela conduit les chercheurs à suggérer: «Les conformations de préfusion ouvertes de la protéine de pointe que nous observons in situ, mais pas après concentration, sont fragiles et peuvent être affectées par les procédures de purification, ce qui a des implications pour les stratégies de vaccination.»

La structure du trimère S in situ, à la surface du virion, a été dérivée, montrant la position de 17 des 22 sites prédits de N-glycane sur le monomère, les 5 autres étant dans la tige ou sur le NTD.

Ils commentent: «Dans l'ensemble, notre structure est très similaire à celle précédemment publiée pour l'ectodomaine trimérique soluble sous forme de préfusion fermée stabilisée par une double mutation proline. Cela fournit une validation importante de l'utilisation de trimères de protéine S recombinants purifiés pour la recherche, le diagnostic et la vaccination. »

L'étude montre que cryoEM peut être utilisé pour étudier la liaison anticorps-Spike sur la surface virale, une étape vitale pour découvrir comment les anticorps neutralisants, et ceux dirigés contre la sous-unité S2 et la région de la tige, en particulier, inhibent l'infection virale et dans la mise en forme préventive vaccins.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.

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