Des scientifiques développent des organoïdes pulmonaires humains pour étudier l'infection par le SRAS-CoV-2

La pandémie actuelle de COVID-19 causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est connue pour cibler principalement le poumon distal, y compris les bronchioles terminales et les alvéoles, qui sont les sites d'échange gazeux essentiels dans le corps humain.

Chez une minorité significative de patients, cela entraîne une pneumonie critique et un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Cependant, le mécanisme par lequel cela se produit est loin d'être clair, et l'un des principaux facteurs contribuant à ce manque de connaissances est l'absence d'un système de culture de cellules pulmonaires humaines fiable et robuste qui servira de substrat à la maladie des poumons terminaux.

Développement d'une culture pulmonaire distale robuste à long terme

Maintenant, une nouvelle étude publiée sur le serveur de pré-impression bioRxiv * en juillet 2020, le développement d'un système de culture pulmonaire distale humaine pouvant être testé fonctionnellement. Cela aidera non seulement à comprendre comment cette infection produit la maladie, mais aussi à tester la capacité proliférative des cellules souches dans cette partie du corps.

À l'heure actuelle, les études sur la souris fournissent la plupart de nos connaissances sur ces cellules souches, qui font partie fonctionnellement du poumon et fournissent une source de nouvelles cellules pendant la guérison du poumon. Ces études ont montré que ces cellules souches bifonctionnelles du poumon distal comprennent les cellules du club sécrétoire trouvées dans les bronchioles distales et les pneumonocytes de type 2 ou cellules alvéolaires (AT2) qui produisent le surfactant dans les alvéoles pulmonaires.

De telles études ont également montré qu'il existe à la fois une population de progéniteurs alvéolaires, qui donne lieu à la fois à AT1 et AT2 après une lésion pulmonaire, et une population de progéniteurs de type basocellulaire ou bronchioalvéolaire dans les voies aériennes distales qui donnent naissance à des cellules dans les voies respiratoires et les alvéoles. . Cependant, sont-ils identiques aux cellules souches pulmonaires humaines?

Il existe des différences significatives dans la composition des cellules dans les poumons humains par rapport à la souris. D'une part, les cellules basales se produisent dans toutes les voies respiratoires chez l'homme, mais ne sont pas visibles dans les bronchioles terminales chez la souris. Au lieu de cela, les cellules de club effectuent des processus de renouvellement et de réparation ici dans l'épithélium. Deuxièmement, la capacité des cellules AT2 humaines à se renouveler à long terme est inconnue pour le moment.

Organoïdes basaux de culture pulmonaire distale mixte

Organoïdes basaux de culture pulmonaire distale mixte

Limitations des cultures de cellules AT actuelles

Bien qu'il existe plusieurs rapports de cultures de cellules AT, celles-ci montrent une faible expansion en raison du lent renouvellement cellulaire. En outre, ils ont besoin de cellules d'alimentation pour leur entretien. Cela conduit à la présence de facteurs inconnus, qui pourraient potentiellement introduire des variations biologiques et les rend moins utiles à des fins de dépistage. L'utilisation de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pour produire des cellules AT2 par différenciation dirigée peut également être moins utile que prévu pour les mêmes raisons, et en outre, est inefficace et limitée par l'expression persistante de gènes immatures ou fœtaux.

Formation d'organoïdes alvéolaires et basocellulaires pulmonaires 3D

Les chercheurs ont découvert que dans leurs organoïdes pulmonaires en 3D, les cellules AT2 humaines se renouvelaient considérablement et étaient également capables de se transdifférencier en cellules AT1. Deuxièmement, ils ont constaté que les organoïdes basocellulaires dans une culture mixte de cellules pulmonaires distales formaient d'abord des masses solides avec le marqueur KRT5, mais après environ un mois, développaient des lumières uniques ou parfois multiples dans environ la moitié des masses. Les cellules luminales ont perdu ce marqueur, mais d'autres cellules, à savoir les cellules ciliées exprimant la tubuline acétylée et les marqueurs SCGB1A1, ont fusionné au niveau de la lumière.

Les cellules basales 1 donnent une élévation aux cellules basales 2

Troisièmement, le séquençage de l'ARN unicellulaire des cellules basales organoïdes avec le marqueur KRT5 provenant de plusieurs sources a montré deux sous-ensembles de cellules, basale 1 et basale 2. Le premier a montré la capacité à se différencier ainsi que des marqueurs de la détermination du destin cellulaire, avec une sous-population qui montraient des marqueurs de prolifération. Il avait également des marqueurs d'ARNm basocellulaires pulmonaires classiques comme l'intégrine α6, ainsi que l'intégrine β4. Basal 2 avait des marqueurs concernés par le métabolisme du réticulum vésiculaire et endoplasmique ainsi que l'expression des cellules squameuses.

La sous-population basale 1 a exprimé le marqueur TNFRSF12A sur la membrane cellulaire, qui peut être utilisé pour différencier un sous-ensemble de cellules enrichies pour un module de gène prolifératif, contrairement aux autres marqueurs. Ainsi, ce marqueur pourrait aider à sélectionner les progéniteurs de cellules basales humaines.

Lorsque les organoïdes pulmonaires distaux totaux ont été séparés par l'utilisation d'un anticorps monoclonal contre ce marqueur, ils ont constaté que les cellules avec TNFRSF12A diminuaient lentement en nombre avec le temps, mais avaient une capacité quatre à 12 fois plus élevée pour la formation d'organoïdes clonogéniques.

En outre, l'analyse FACS a montré que les cellules basales 2 provenaient probablement de cellules basales 1. Les cellules basales 1 se regroupent dans le poumon distal in vivo et ont un potentiel clonogénique plus élevé. En d'autres termes, ils agissent comme des cellules souches dans les poumons.

Infections d'organoïdes par le SRAS-CoV-2 et les virus grippaux

Les chercheurs ont pu établir une infection par ces virus dans les organoïdes pulmonaires distaux, fournissant la preuve que ceux-ci sont adaptés à la modélisation des maladies infectieuses humaines. Étant donné que H1N1 endommage à la fois les voies respiratoires et l'épithélium alvéolaire, les organoïdes basaux et AT2 ont été infectés par une souche de virus H1N1 recombinante, qui a exprimé la protéine fluorescente GFP lors de sa réplication. Ils ont découvert que l'ARN génomique viral s'accumulait dans le surnageant en 96 heures. Ces organoïdes semblaient également posséder des récepteurs fonctionnels pour le virus de la grippe, similaires à ceux du poumon intact.

Lorsque le médicament zanamivir a été ajouté avant le virus, il n'y a eu aucun impact sur la réplication virale ou l'infection, car il s'agit d'un inhibiteur sélectif de la libération virale des cellules infectées. Cependant, le médicament analogue de nucléoside Fdc qui s'est avéré réduire la réplication de nombreuses familles virales était efficace. Le virus exprimant la GFP a permis à de nombreuses classes antivirales du composé d'être criblées pour une efficacité différentielle, ce qui indique que ce modèle est utile dans la découverte de produits thérapeutiques évolutifs.

Adaptation des organoïdes à l'infection par le SRAS-CoV-2

Les organoïdes 3D à long terme actuels ont généralement l'aspect basal face à la matrice extracellulaire, ou vers l'extérieur, mais cela pourrait empêcher l'infection de la surface luminale, qui porte les récepteurs ACE2, par le SARS-CoV-2. Les chercheurs ont donc utilisé une méthode d'éversion pour générer une ligne robuste d'organoïdes avec l'orientation apex-out, ce qui augmente les interactions entre l'hôte et le pathogène sur la surface luminale.

Cela a abouti à la formation de sphéroïdes apex-out de l'épithélium où les cils, les microvillosités et les jonctions apicales font face vers l'extérieur, accélérant en 5 jours jusqu'à la différenciation progressive des cellules ciliées tournées vers l'extérieur pendant des semaines. Il s'agit d'une amélioration par rapport aux protocoles actuels de culture cellulaire. Ceux-ci ont également montré des cellules de club avec des granules de sécrétion à l'apex orienté vers l'extérieur, et l'apparition ultérieure de cellules AT1 dans les organoïdes alvéolaires.

Ces organoïdes mixtes apex-out étaient facilement sensibles à l'infection avec réplication du génome du SRAS-CoV-2 72 heures après la visualisation de l'infection ainsi qu'à la production de la protéine de nucléocapside. Ceci contraste avec le cisaillement mécanique requis pour les organoïdes intestinaux pour permettre une infection des cellules apicales par le virus.

Environ 10% des cellules AT2 et des cellules organoïdes basales étaient infectées. Dans ce dernier sous-ensemble, le virus infectait principalement les cellules du club. Cela représente une nouvelle cible pour le virus, qui pourrait nuire à la production de glycosaminoglycanes, un revêtement protecteur pour les tissus pulmonaires. La perte de ceci pourrait déclencher un cercle vicieux d'infection par le SRAS-CoV-2.

Implications et applications futures

Les chercheurs résument: «Ici, nous avons décrit une méthode robuste, sans alimentateur et chimiquement définie pour la croissance des voies respiratoires distales humaines et alvéolaires clonogéniques organoïdes à long terme, qui a été appliquée à la découverte de progéniteurs et à la modélisation des maladies infectieuses.

Ils prévoient l'application de cette méthode de culture de progéniteurs pour tous les progéniteurs épithéliaux pulmonaires distaux chez l'homme adulte pour modéliser les maladies pulmonaires infectieuses, interstitielles et néoplasiques, ainsi que l'ingénierie tissulaire et la médecine de précision.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.

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