Défis de la cytométrie en flux à haute complexité

La dernière décennie a vu une révolution dans l'immunothérapie du cancer. La demande des médecins, des chercheurs et des sociétés pharmaceutiques pour des résultats plus précis avec une sensibilité élevée et des tests de haute qualité augmente énormément.

Dans cette interview, Dra. Mª Josépa Marco du Département d'hématologie de l'hôpital Le Dr Peset parle à News-Medical Life Sciences de la cytométrie en flux de haute complexité et des défis auxquels ils sont souvent confrontés.

Veuillez donner un aperçu de la cytométrie en flux de haute complexité. Qu'est-ce qui contribue à sa complexité par rapport à la cytométrie en flux de faible complexité?

Beaucoup de gens confondent le terme cytométrie en flux à haute complexité (HCFC) avec la simple augmentation du nombre de paramètres que nous pouvons mesurer sur un cytomètre. Pour moi, ce concept est quelque chose de beaucoup plus complexe. Lorsque nous parlons de HCFC, nous ne parlons pas seulement du nombre de couleurs, mais aussi de la qualité, de l'automatisation, des outils d'analyse, des réactifs et du personnel.

Effectuer des HCFC signifie améliorer chacun de ces aspects pour obtenir des résultats plus complets, précis et de meilleure qualité; et, dans mon cas, cela affecte directement la qualité de vie de mes patients.

Pourquoi la cytométrie en flux de haute complexité est-elle utilisée? Quelles sont les applications de cette technique?

Au cours de la dernière décennie, nous avons vécu une révolution dans l'immunothérapie anticancéreuse. Des avancées significatives ont été observées non seulement dans le ciblage direct des antigènes tumoraux de surface via de nouveaux anticorps monoclonaux, comme le Daratumumab ou les Bispecific T Cell Engagers (BiTEs) comme le Blinatumomab, mais également dans le domaine de la Thérapie Cellulaire Adoptive (ACT) avec le développement des cellules T du récepteur d'antigène chimérique (cellules CAR T) ou l'identification de molécules qui surmontent la suppression immunitaire inhibitrice créée par les cellules tumorales.

L'immunophénotypage par cytométrie en flux joue un rôle central et très pertinent dans nombre de ces thérapies. En d'autres termes, la cytométrie en flux n'est pas seulement utilisée pour le diagnostic et la classification des lymphomes et des leucémies, mais aussi pour la détection de la maladie résiduelle minimale (MRD) après le traitement, pour étudier la réponse immunitaire des patients, et même pour le contrôle de la progression du traitement lui-même. , comme la surveillance du nombre de cellules CAR-T qui restent actives chez le patient après la perfusion.

Pour toutes ces raisons, les médecins et les sociétés pharmaceutiques exigent des résultats plus précis de tests de haute sensibilité et de meilleure qualité. Il est nécessaire d'apporter des améliorations à chaque aspect des HCFC.

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Qu'est-ce que la détection de la maladie résiduelle minimale (MRD) et comment la cytométrie en flux peut-elle être utilisée pour sa détection?

La maladie résiduelle minimale (mesurable) (MRD) fait référence au petit nombre de cellules cancéreuses qui restent dans le corps après le traitement. Les mesures diagnostiques traditionnelles, telles que l'immunohistochimie et la morphologie, ont des sensibilités de détection de seulement 10-2 – dix-3, qui ne prédisent pas de manière fiable la survie sans progression (SSP) ou la survie globale (SG) après ces traitements.

La capacité d'identifier les cellules pathologiques peut fournir des informations précieuses sur la réponse clinique et le risque de rechute. La négativité MRD est systématiquement associée à une amélioration de la survie sans progression et globale. S'il est correctement validé et standardisé, il pourrait être utilisé comme biomarqueur de substitution dans les essais cliniques évaluant de nouvelles thérapies. Ensuite, il y a un intérêt clinique croissant pour la mesure et la réalisation de la négativité MRD dans plusieurs maladies hématologiques, par exemple dans le myélome multiple, où les procédures MRD sont actuellement plus développées.

La surveillance MRD du myélome multiple est actuellement effectuée avec des plates-formes sensibles telles que la réaction en chaîne de l'oligonucléotide polymérase spécifique à un allèle (ASO-qPCR), le séquençage de nouvelle génération (NGS) et la cytométrie en flux multiparamétrique (MFC). ASO-qPCR et NGS ont tous deux d'excellentes sensibilités de détection (10-5 – dix-6), mais ces technologies ont une applicabilité inférieure par rapport à MFC.

Le MFC conventionnel peut facilement atteindre une sensibilité de détection de 10-4, mais pour atteindre la sensibilité élevée requise pour l'évaluation MRD, des millions de cellules doivent être acquises et les protocoles d'immunophénotypage conventionnels sont incapables d'atteindre ces chiffres. Les directives consensuelles actuelles exigent un minimum de 2 millions et recommandent l'acquisition de 5 millions d'événements pour atteindre une sensibilité minimale de 10-5.

En d'autres termes, nous avons dû augmenter la spécificité et la sensibilité de la technique pour acquérir un plus grand nombre d'événements et pour différencier les plasmocytes normaux des plasmocytes anormaux.

Quels sont les défis liés à l'adoption de la cytométrie en flux de haute complexité?

À mon avis, ces défis peuvent être inclus en trois grandes étapes. Nous devons nous concentrer sur l'amélioration des processus de coloration, d'acquisition et d'analyse. Bien entendu, à tous les niveaux, il faut introduire des éléments de qualité accréditée, qui dans mon cas doivent être valables pour le diagnostic clinique.

Si nous nous concentrons sur les procédures de coloration des échantillons, nous pensons d'abord à l'introduction de processus d'automatisation pour réduire les temps de coloration et éliminer les erreurs humaines. Les panels d'immunophénotypage sont de plus en plus compliqués à adopter le HCFC, ce qui affecte directement le temps qu'un technicien passe sur la manipulation des réactifs.

L'amélioration des processus d'acquisition est peut-être plus directement liée au développement de cytomètres en flux haute performance avec de nombreux paramètres pour l'acquisition de panels complexes. Ils doivent également avoir une capacité élevée de traitement des données et, pour faciliter le contrôle de la qualité, ils doivent faciliter le suivi des performances, de l'étalonnage et des processus de compensation et de normalisation entre les cytomètres.

Enfin, nous avons besoin de personnel qualifié, ainsi que de logiciels d'analyse qui nous permettent de mettre en œuvre des stratégies d'analyse complexes, et qui peuvent traiter un grand nombre d'événements et de paramètres.

Comment les photodiodes à avalanche (APD) peuvent-elles être utilisées à la place des tubes photomultiplicateurs (PMT) pour aider à simplifier la technologie utilisée?

J'ai une vaste expérience de l'utilisation des cytomètres CytoFLEX en laboratoire pour des projets de recherche intra-laboratoire en oncologie, pneumologie et néphrologie. Ce cytomètre comprend des APD (photodiodes à avalanche) au lieu de PMT (tubes photomultiplicateurs) comme détecteur de photons. Mes commentaires sur les APD sont positifs.

Premièrement, il a montré une grande linéarité entre les intensités mesurées (MFI) et les réglages de gain du détecteur. D'un point de vue pratique, le logiciel peut recalculer automatiquement les valeurs de débordement en temps réel à mesure que les gains sont ajustés. Cela m'a permis d'utiliser la même expérience de compensation dans des panneaux avec des réglages de gain différents. Ainsi, aucun temps supplémentaire n'est nécessaire pour effectuer un étalonnage de compensation contrairement aux cytomètres en flux traditionnels utilisant des détecteurs PMT.

Une autre caractéristique remarquable est sa fluorescence sensibilité et faible bruit électronique. La sensibilité est la capacité de mesurer des signaux de faible intensité – en d'autres termes, de voir des populations sombres et lumineuses dans le même échantillon. Lors de l'acquisition d'un nombre élevé d'événements pour les études MRD, la sensibilité est cruciale car les modèles d'expression d'antigène de populations normales abondantes peuvent chevaucher les modèles d'expression de populations de cellules anormales rares.

Ainsi, pour obtenir la discrimination la plus claire entre les cellules normales et anormales, je recommande la cytométrie en flux à haute complexité (HCFC), où des techniques de coloration innovantes et un cytomètre en flux à technologie APD sont adoptés.

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Comment les logiciels et la compensation de paramètres de test particuliers peuvent-ils aider les chercheurs avec une cytométrie en flux de haute complexité?

Je suis convaincu que, pour la plupart des utilisateurs de cytométrie en flux, tout outil facilitant la compensation automatique grâce à un logiciel intuitif et simple d'utilisation est aujourd'hui indispensable. Cela est particulièrement vrai lors de la réalisation d'études de cytométrie en flux de haute complexité, qui nécessitent un plus grand nombre de panneaux multicolores, où la combinaison de toute la fluorescence génère une grande matrice de compensation.

Dans notre évaluation DxFLEX, nous avons réalisé que la compensation de 13 couleurs est très simple (nous travaillons généralement avec entre 8 et 10 couleurs). Il suffit de colorer des tubes individuels pour chaque fluorescence à étudier, de les acquérir à l'aide du module de compensation automatique et de paramétrer le logiciel pour calculer la matrice de compensation. Cette matrice de compensation peut être enregistrée dans une bibliothèque de compensation qui peut être utilisée en combinaison avec les paramètres de gain du catalogue pour créer toute combinaison de paramètres dans un panneau.

Ces fonctionnalités permettent de gagner beaucoup de temps dans la création d'expériences et dans le contrôle des performances des cytomètres, en plus de faciliter les flux de travail.

Comment les réactifs CE-IVD sont-ils utilisés dans la cytométrie en flux de haute complexité? Pourquoi est-il important de les utiliser et quels défis supplémentaires apportent-ils?

Aujourd'hui, nous sommes sous la pression croissante de l'administration gouvernementale et des établissements de santé pour nous conformer à une série de réglementations et d'accréditations de contrôle qualité des laboratoires afin de garantir la qualité et la fiabilité des résultats. Dans ce cadre, et dans les locaux même des appels d'offres publics, le marquage CE-IVD est de plus en plus nécessaire pour les équipements, mais aussi pour les réactifs. L'un de nos plus grands défis est donc d'augmenter le nombre de réactifs avec cette qualification, car, en plus de faciliter l'accréditation, ils minimisent la validation interne et donnent des résultats fiables pour éviter la répétition des tests.

Par exemple, les anticorps marqués CE-IVD garantissent des produits de qualité, la haute performance des fluorochromes en tandem et la cohérence d'un lot à l'autre, autant de caractéristiques importantes dans les expériences sur les HCFC. Trouver le fabricant avec le plus grand catalogue de ces produits fera la différence.

Que peut-on faire avec la préparation d'échantillons pour simplifier la cytométrie en flux de haute complexité?

Pour simplifier la préparation d'échantillons de haute complexité, vous pouvez choisir d'automatiser le processus ou d'utiliser des tubes prédéfinis avec un cocktail d'anticorps unitaires.

Dans notre laboratoire, nous avons une vaste expérience avec les tubes Beckman Coulter DURAClone dans des projets de recherche. Ces tubes contiennent une combinaison d'anticorps monoclonaux pré-distribués et séchés au fond du tube. Leur utilisation nécessite moins de temps pratique et minimise les erreurs de pipetage. Ces fonctionnalités nous ont permis d'améliorer considérablement nos flux de travail de laboratoire et de réduire les coûts grâce à une réduction des erreurs.

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Que propose la cytométrie en flux Beckman Coulter pour aider à surmonter les défis de la cytométrie en flux à haute complexité?

L'une de mes plus grandes préoccupations dans la routine quotidienne de notre laboratoire était la nécessité d'acquérir un nombre suffisamment grand d'événements pour atteindre une sensibilité de 10-6 dans l'étude MRD pour le myélome multiple. Avec DxFLEX, nous avons atteint cet objectif, car nous avons pu acquérir jusqu'à 25 millions d'événements par acquisition.

De plus, nous avons pu tester sa configuration maximale avec des panneaux de 13 couleurs qui apportent une plus grande spécificité et complexité à l'analyse, tout en réduisant le nombre de tubes par panneau d'étude.

De plus, nous avons également amélioré les flux de travail dans le traitement des échantillons en optimisant nos LDT (Tests développés en laboratoire) en adoptant la technologie DURAClone, et dans le processus d'acquisition avec les modules de compensation automatique, de standardisation, de contrôle qualité quotidien et de surveillance des performances inclus dans le logiciel DxFLEX.

Lorsque je suis devenu utilisateur de cytométrie en flux pour la première fois, j'ai travaillé avec une autre société commerciale. Quand j'ai commencé à travailler avec Beckman Coulter Life Sciences, j'ai été agréablement surpris par leurs connaissances technologiques, mais aussi par la qualité du soutien humain et scientifique derrière leurs produits, y compris la formation du personnel et la volonté de nous aider à mettre en œuvre de nouvelles techniques.

Quel est l'avenir de la cytométrie en flux à haute complexité?

Je crois que l'évolution naturelle du HCFC continuera d'exiger de nouveaux outils pour améliorer les processus de coloration, d'acquisition et d'analyse. De cette façon, je suis heureux de voir que Beckman Coulter Life Sciences développe des produits qui fournissent des solutions pour chacun de ces points, tels que, par exemple, la technologie DURAClone pour améliorer les processus de coloration, et des équipements avancés tels que DxFLEX pour améliorer les processus d'acquisition .

Cependant, je pense que l'un des plus grands défis sera lors du traitement des données, car bientôt nous serons plus capables d'augmenter le nombre d'échantillons traités et le nombre de paramètres analysés. Cela nous conduira progressivement vers une analyse monocellulaire de grande dimension, qui présente ses propres défis en termes de gestion des données, de visualisation des données, de reproductibilité des résultats, de puissance de calcul et de partage d'informations.

En ce sens, j'attends beaucoup de Beckman Coulter à la suite de leur acquisition du logiciel Cytobank, qui permet le cloud computing pour l'analyse par cytométrie de flux. Le développement en cours par les équipes logicielles Cytobank et Kaluza est prometteur, et j'espère inclure ces nouveaux outils dans les recherches futures.

Où les lecteurs peuvent-ils trouver plus d'informations?

Pour en savoir plus, visitez:

  • Critères de consensus du Groupe de travail international sur le myélome pour la réponse et l'évaluation minimale de la maladie résiduelle dans le myélome multiple. Kumar S, Paiva B, Anderson KC, Durie B, Landgren O, Moreau P, et al. Lancette Oncol. (2016) 17: e328–46. doi: 10.1016 / S1470-2045 (16) 30206-6
  • Lignes directrices consensuelles sur l'analyse et la notification de la maladie résiduelle minimale du myélome plasmocytaire. Arroz M, Came N, Lin P, Chen W, Yuan C, Lagoo A, et al. Cytométrie B Clin Cytom. (2016) 90: 31–9. doi: 10.1002 / cyto.b.21228
  • Flux de nouvelle génération pour une détection hautement sensible et standardisée de la maladie résiduelle minimale dans le myélome multiple. Flores-Montero J, Sanoja-Flores L, Paiva B, Puig N, Garcia-Sanchez O, Böttcher S et al. 2017 Leucémie octobre; 31 (10): 2094-2103. doi: 10.1038 / leu.2017.29
  • Maladie résiduelle mesurable par cytométrie en flux de nouvelle génération dans le myélome multiple. Paiva B, Puig N, Cedena MT, Rosiñol L, Cordón L, Vidriales MB, et al. 2020 J Clin Oncol. 10 mars; 38 (8): 784-792. doi: 10.1200 / JCO.19.01231
  • Directives pratiques pour l'optimisation et la caractérisation du Beckman Coulter CytoFlexTM Plate-forme. Bhowmick D, Sheridan RTC, Bushnell TP, Spalding KL. 2020 Cytométrie partie A. doi: 10.1002 / cyto.a.23998
  • Un nouveau cytomètre en flux basé sur des semi-conducteurs avec une sensibilité de diffusion de la lumière améliorée pour l'analyse des nanoparticules biologiques. Brittain GC, Chen YQ, Nartinez E, Tang VA, Tylre M R, Langlois MA, Gulnik. Sci Rep 2019 5 novembre; 9 (1): 16039. doi: 10.1038 / s41598-019-52366-4
  • https://www.mybeckman.uk/flow-cytometry/instruments/dxflex?country=GB

A propos de Mª Josépa Marco

Dra. Mª José Marco est hématologue au département d'hématologie de l'hôpital Dr. Peset, à Valence, en Espagne. Après avoir obtenu son diplôme de médecine à l'Université de Valence, en Espagne, elle a acquis une vaste expérience dans le diagnostic de cytométrie en flux impliquant l'immunophénotypage de la leucémie et du lymphome.

Au laboratoire d'hématologie spécialisé, elle a toujours eu la responsabilité de soins de santé en cytométrie en flux, et elle a été un partisan de l'introduction d'adaptations technologiques possibles et nécessaires pour améliorer les soins aux patients. Ses recherches se sont concentrées sur les aspects cliniques-biologiques, diagnostiques et des maladies résiduelles minimes avec une cytométrie en flux de grande complexité – principalement sur les gammapathies monoclonales – et elle aide à la conception et au développement d'essais cliniques sur l'état immunitaire chez les patients atteints de cancer et de transplantations d'organes.

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