Déchiffrer le plus grand système CRISPR

Le professeur Guillermo Montoya a parlé à News-Medical de ses recherches qui impliquaient de visualiser le système CRISPR le plus grand et le plus complexe, qui pourrait avoir des applications potentielles dans le diagnostic biomédical.

Qu'est-ce qui a provoqué votre recherche sur CRISPR?

Mon intérêt pour les interactions protéine-ADN et l'édition du génome a commencé il y a quelque temps lorsque j'ai collaboré avec une société de biotechnologie appelée Cellectis. Nous avons effectué des études biophysiques et résolu les structures cristallines des endonucléases d'origine.

Ces enzymes ont été l'un des premiers échafaudages de protéines envisagés comme des ciseaux moléculaires pour l'édition du génome. Nous avons été l'un des premiers à montrer que des endonucléases à tête modifiée avec de nouvelles spécificités de liaison à l'ADN étaient capables de corriger des mutations dans des cellules humaines impliquées dans des maladies telles que Xeroderma pigmentosum (Redondo et al Nature 2008).

La découverte de CRISPR et la découverte qu'un simple échange de la séquence de la molécule d'ARN associée pouvait diriger sa coupe vers la séquence désirée a été une révolution dans le domaine. Nous avons donc commencé à nous intéresser à CRISPR et à sa fascinante biologie.

CRISPR / Edition de gènes

Crédit d'image: Nathan Devery / Shutterstock.com

À quoi servent les systèmes CRISPR dans l'industrie scientifique?

Les utilisations sont multiples, allant des applications d'édition du génome à la correction des mutations ex-vivo dans les maladies monogéniques au diagnostic par exemple du cancer ou du COVID-19, à la possibilité de les utiliser comme déclencheur pour délivrer des médicaments contenus dans des hydrogels dans un temps précis et endroit. Le nombre d'applications possibles augmente chaque jour et de nombreuses applications n'ont pas encore été découvertes.

Pouvez-vous décrire comment vous avez cartographié et analysé le complexe Cmr-β?

Nous avons isolé le complexe et utilisé une technique appelée cryo-microscopie électronique (cryoEM) pour obtenir des cartes de la densité coulombique des atomes formant la molécule.

Nous avons utilisé ces cartes pour construire les modèles de la particule de ribonucléoprotéine.

CyroEM

Comment CryoEM a-t-il été utilisé dans votre recherche?

Comme mentionné précédemment, nous avons obtenu des cartes de la densité de la molécule en faisant la moyenne de centaines de milliers d'images du complexe en utilisant une méthode appelée moyenne d'une seule particule.

Ces cartes nous permettent d'identifier où les acides aminés et nucléotides composant la protéine et les acides nucléiques sont organisés dans l'espace 3D. À l'aide de programmes de construction de modèles informatiques, nous construisons les modèles qui nous aident à comprendre comment les différentes activités du complexe sont coordonnées.

Pourquoi le complexe Cmr-β est-il si compliqué à analyser et à cartographier?

Cela a été un travail vraiment difficile, je dirais l'un des plus compliqués de ma carrière, car le complexe est d'environ 1 MDa de poids moléculaire.

Il contient 37 polypeptides et acides nucléiques différents et 6 centres catalytiques différents: 4 d'entre eux clivent l'ARN cible qui s'hybride avec l'ARNr du complexe, un centre synthétise un tétra oligoadénylate moléculaire cyclique qui active les RNases auxiliaires et le dernier clive l'ADN ss de manière interspécifique.

Trouver la coordination allostérique entre eux a nécessité de nombreuses études biochimiques.

Après avoir cartographié ce complexe, qu'avez-vous découvert sur son rôle dans la réponse immunitaire?

Nous savons maintenant que Cmr-beta a un mécanisme différent pour reconnaître les ARN envahisseurs de l'auto-ARN et déclencher la réponse immunitaire.

De plus, nous soupçonnons que l'une des sous-unités, Cmr7, peut fonctionner comme un «bouclier» pour protéger le complexe de l'action des anti-crisprs, qui sont de petites protéines qui peuvent désactiver le complexe effecteur en se liant à des endroits clés de l'effeto complexe.

Quelles applications potentielles ce complexe pourrait-il avoir?

Nous ne le savons pas encore, je ne prévois pas d'applications pour ce système en édition, mais je n'écarte pas qu'il puisse être réglé pour d'éventuelles applications biotechnologiques. De plus, nous avons comblé un manque de connaissances fondamentales sur les complexes effecteurs CRISPR-Cas de type III.

La science fondamentale est essentielle pour apporter des informations qui nous aident à comprendre comment les choses fonctionnent. Plus tard, une fois cette compréhension terminée, nous pouvons commencer à repenser la nature et à réfléchir aux applications. C'est un concept important, par exemple, nous utilisons aujourd'hui la PCR (réaction en chaîne par polymérase) pour détecter le COVID-19. Cela aurait été impossible sans des études antérieures sur les polymérases thermostables, qui ouvrent la voie à la PCR. Karin Mullis a reçu le prix Nobel pour sa découverte.

Comment une étude plus approfondie de ce complexe pourrait-elle aider à lutter contre la résistance aux antibiotiques?

C'est l'un des aspects sur lesquels je pense que notre découverte pourrait avoir des applications futures car dans de nombreux cas, la résistance aux antibiotiques est due à des éléments génétiques mobiles (phages et plasmides) porteurs de gènes de résistance.

Il se peut que l'utilisation de ces complexes, après leur refonte, puisse être utilisée pour lutter contre les bactéries résistantes.

Bactéries résistantes aux antibiotiques

Crédit d'image: Kateryna Kon / Shutterstock.com

Quelles sont vos prochaines étapes dans cette recherche?

Nous essaierons de comprendre pourquoi il existe une combinaison de différents systèmes CRISPR dans certaines bactéries et comment ils coordonnent la réponse immunitaire.

Où les lecteurs peuvent-ils trouver plus d'informations?

A propos du professeur Guillermo Montoya

Guillermo Montoya est professeur ordinaire à l'Université de Copenhague (UCPH) et directeur de recherche du programme Protein Structure & Function au Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research (http://www.cpr.ku.dk/) depuis 2014. Montoya est également président de l'ISBUC, le cluster de biologie structurale intégrative de l'UCPH (http://isbuc.ku.dk/).Professeur Guillermo Montoya

Au cours des dernières années, ses principaux intérêts de recherche sont l'analyse structurelle de complexes macromoléculaires, tels que le complexe chaperonine CCT de mammifère, où il utilise une combinaison de cristallographie aux rayons X et de microscopie électronique pour mieux comprendre leurs mécanismes de travail. Le Dr Montoya poursuit également systématiquement l'analyse structure-fonction des endonucléases, qui sont d'un grand intérêt en raison de leurs applications potentielles en thérapie génique.

Récemment, il a résolu la structure d'un nouveau membre de CRISPR-Cas, Cpf1, qui peut ouvrir de nouvelles voies dans la modification du génome. Il est membre de comités internationaux d'évaluation de projets et examine également des projets pour des agences de financement européennes (ERC, EU, SNF, DFG, ANR, NOW, MINECO, Welcome Trust, Vinnova) et sert de rédacteur associé et de réviseur ad hoc pour revues. Montoya a été élu membre de l'EMBO en 2018 et a reçu la bourse Novo Nordisk Distinguished Investigator Grant en avril 2019.

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