La pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a provoqué d’énormes ravages pour la vie et le bien-être humains. Il est peu probable que les difficultés actuelles prennent fin si l’immunité de la population n’est pas atteinte. L’agent causal du COVID-19, le coronavirus-2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), s’est propagé dans toutes les régions du monde, avec plus de 106 millions d’infections documentées et plus de 2,3 millions de victimes à ce jour.
Une équipe de chercheurs a récemment examiné le transcriptome du SRAS-CoV-2 et la dynamique du site de clivage de la furine du gène S dans l’épithélium des voies respiratoires humaines primaires. L’équipe a publié ses conclusions sur le bioRxiv* serveur de pré-impression.
Sommaire
Pic de SRAS-CoV-2
Ce virus possède un grand génome de 30 kb, codant ses protéines structurelles et non structurales, ainsi que plusieurs protéines accessoires. Les protéines de pointe des différents coronavirus partagent une homologie de 77%.
La protéine de pointe du SRAS-CoV-2 a deux sous-unités, S1 et S2. S1 médie la liaison du récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) de la cellule hôte de pointe virale, tandis que S2 médie l’entrée virale dans la cellule hôte par fusion membranaire.
La protéine de pointe est l’antigène immunodominant dans l’infection humaine, en plus de jouer le rôle central dans le type de cellule hôte ciblée par le virus, la pathogénicité du virus et sa transmissibilité. Dans la nature, il se présente sous la forme d’un homotrimère à la surface de la particule virale.
Surtout, le pic de SARS-CoV-2 est différent de celui des coronavirus de type SRAS de chauve-souris étroitement apparentés codant pour un site de clivage de la furine polybasique unique (FCS) à l’interface S1 / S2. Celui-ci est composé de quatre acides aminés, l’ERAR.
Le gène FCS lui-même est composé de la séquence RRAR ↓ S. Sa présence dans ce virus, mais pas dans d’autres bétacoronavirus, indique qu’il est crucial pour la virulence du virus en augmentant la gamme d’hôtes, la gamme de tropisme cellulaire, sa transmissibilité et sa pathogénicité.
Émergence rapide des suppressions de FCS
Lorsqu’il est cultivé dans des cellules Vero, dérivées de cellules de singe vert africain, le SRAS-CoV-2 a rapidement produit des mutations interfaciales S1 / S2 qui comprenaient la perte du FCS avec les acides aminés proximaux et distaux dans ses virions de descendance. Ceux-ci formaient une population dominante stable avec des passages répétés.
Le gène de pointe est le plus variable parmi tous les gènes du SRAS-CoV-2, et la région FCS à l’interface S1 / S2 est particulièrement sujette aux mutations. Diverses délétions et mutations ont été identifiées dans cette région dans des cellules Vero infectées par le virus.
En particulier, un mutant comprenant une délétion de 30 paires de bases a pu se répliquer plus efficacement dans les cellules Vero, devenant ainsi la souche dominante lors du passage. Une autre suppression de 21 paires de bases a également été trouvée après deux ou trois passages. Cependant, ils n’ont pas été trouvés dans l’isolat clinique qui a été à l’origine passé. Cela montre que ceux-ci ont été acquis lors des passages de cellules Vero.
Les isolats cliniques montrent la présence de nombreuses délétions autour du FCS. L’étude actuelle visait à comprendre comment ceux-ci se sont produits pendant la croissance du virus dans les voies respiratoires humaines.
Détails de l’étude
Les chercheurs ont utilisé des méthodes de séquençage de l’ARN pour explorer la transcription du virus dans des cellules infectées d’épithélium des voies respiratoires humaines (AOH), cultivées pour simuler une infection naturelle des voies respiratoires humaines. Ceci a été réalisé en les cultivant à une interface air-liquide (HAE-ALI).
Cette méthode de culture a donné un modèle transcriptomique qui ressemblait plus étroitement à celui de l’épithélium des voies respiratoires humaines ordinaires chez les patients COVID-19. Dans les cultures de cellules HAE-ALI et Vero infectées par le SRAS-CoV-2, les transcrits de nucléocapside (N), sous forme d’ARN sous-génomique (sgRNA), étaient abondants, avec des niveaux inférieurs de transcrits de pointe (S).
Ils ont constaté que des différences significatives concernaient principalement les suppressions à l’interface S1 / S2. Le taux élevé de délétions de FCS a contribué à un pourcentage beaucoup plus faible de sgRNA par rapport à tous les sgRNA canoniques, à seulement 50%, dans les cellules HAE-ALI infectées.
Deux délétions dans le FCS ont été trouvées à des niveaux considérablement améliorés dans deux cultures. L’un est une délétion de 12 acides aminés (mut-del1), 678TNSPRRAR ↓ SVAS689, y compris le FCS. La seconde est une délétion de 5 acides aminés (mut-del2), 675QTQTN679, immédiatement en amont du FCS.
Sélection spécifique aux donateurs
Ils ont observé une pression de sélection spécifique au donneur opérant dans ces cellules HAE-ALI pour empêcher ou sélectionner de telles délétions. Cela a été démontré par la présence de mut-del2 dans 42% des cellules infectées à 21 jours après l’infection et de mut-del1 dans 54% à 13 jours après l’infection, dans deux des sept cultures cellulaires différentes basées sur des cellules obtenues à partir de différentes donateurs.
Mut-del1 peut être plus important cliniquement que mut-del1, ayant été trouvé dans trois des 68 échantillons dans une étude antérieure.
Inversement, l’émergence de délétions de FCS a été supprimée dans cinq autres cultures, avec moins de 1% des délétions étant trouvées au jour 13 post-infection. Ainsi, les cultures de HAE-ALI de différents donneurs ont conduit à la sélection de différentes délétions de FCS.
Suppression de FCS et entrée virale
Mut-del2 n’entraîne pas la perte du FCS, mais empêche le clivage médié par la furine en raison de la mutation en amont. En conséquence, le traitement des pics a été considérablement altéré. Les deux délétions ont conduit à l’incapacité d’utiliser la furine ou le TMPRSS2 pour réaliser la fusion du virus avec la membrane plasmique, inhibant ainsi l’entrée virale dans la cellule.
La gamme de tropisme cellulaire était également limitée par les délétions de FCS. Les cellules qui ont exprimé TMPRSS2 n’ont pas montré la présence de délétions de FCS, soutenant le rôle de ce dernier dans l’abolition de la capacité du premier à médier la fusion virus-cellule.
Cependant, les mutations FCS parmi les virions nouvellement formés se sont accumulées dans deux cultures cellulaires. C’étaient les mêmes isolats de cellules des voies respiratoires qui présentaient des niveaux amplifiés de mutants, indiquant leur permissivité à l’infection par des mutants supprimés par FCS. Cela pourrait être dû au fait que, sans expression élevée de TMPRSS2, ils ont permis l’infection par d’autres voies qui impliquaient l’entrée endosomale dépendant de la cathepsine du virus.
En outre, les résultats de la réduction liée à mut-del2 de l’entrée virale et de l’infection dans les cellules Vero pourraient indiquer que le FCS est un facteur de virulence. Dans ce cas, il devrait réduire la gravité de la maladie pulmonaire chez les animaux. Ainsi, une étude plus approfondie est indiquée pour comprendre à quelle fréquence de telles délétions se produisent dans une infection humaine, comment ces mutants sont transmis entre humains et l’étendue de la pathogénicité.
Analyse par immunofluorescence de l’infection par le SRAS-CoV-2 des cellules HAE. Les cultures HAE-ALIB2-20 ont été infectées avec le SRAS-CoV-2 à une MOI de 0,2 ou 2 pfu / cellule, comme indiqué, infectées simulées (Mock). A 4 jours après l’infection, un morceau de la membrane d’insert a été fixé dans 4% de paraformaldéhyde dans du PBS à 4 ° C pendant une nuit. et soumis à une analyse d’immunofluorescence directe. Les membranes ont été colorées avec une protéine anti-SRAS-CoV-2 N (NP). Les images ont été prises sur un microscope confocal Leica TCS SPE sous 40 ×, qui était contrôlé par le logiciel Leica Application Suite X. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (4 ‘=, 6-diamidino-2-phénylindole). La barre d’échelle est de 20 µM.
Quelles sont les implications?
Ces résultats démontrent que le virus est soumis à une forte pression sélective au sein des cellules des voies respiratoires humaines, pour des mutations adaptatives dans la protéine de pointe. La surveillance pour identifier les mutations de pointe est essentielle pour identifier les mutations d’échappement, ainsi que celles qui affectent ou améliorent l’infectivité ou la transmissibilité virale, ou la virulence. L’étude actuelle a utilisé avec succès le modèle HAE-ALI polarisé pour explorer les mutants de pointe dans une variété de scénarios.
Les chercheurs ont découvert que la force de sélection dans les particules virales libérées apicalement des cellules des voies respiratoires humaines polarisées infectées conduisait à une rétention stable du FCS et à une stabilité globale des pics dans la plupart des cas, à l’exception de deux cultures isolées de deux individus différents. Dans ces deux cas, des taux élevés de suppression de FCS ont persisté.
Notre étude présente des preuves du rôle des propriétés uniques des épithéliums des voies respiratoires humaines dans la dynamique de la région FCS lors de l’infection des voies respiratoires humaines, qui dépend du donneur.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.