Alors que les efforts pour trouver des antiviraux efficaces pour lutter contre la pandémie de COVID-19 causée par le SRAS-CoV-2 se poursuivent, une nouvelle étude explore l’enzyme virale PLpro, codée dans la protéine non structurale nsp3, et ses inhibiteurs. L’étude est apparue sous forme de pré-impression sur le bioRxiv * serveur en décembre 2020.
Développement de nanocorps qui inhibent Nsp3. Crédit d’image: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.12.09.417741v1.full.pdf
Sommaire
La protéine Nsp3
Le génome viral code pour 16 protéines non structurales, dont nsp3 est la plus grande. Il s’agit d’une protéine membranaire à domaines multiples et essentielle dans le complexe de réplication-transcription formé sur les membranes de l’hôte. C’est également une protéase, codant pour la protéase de type papaïne PLpro, qui est nécessaire pour la libération de plusieurs autres protéines non structurales à partir du polypeptide.
L’activité protéolytique de PLpro n’est pas limitée aux polypeptides viraux. Il supprime également l’ubiquitine et l’ISG15 (un modificateur de type ubiquitine, gène 15 stimulé par l’interféron) des protéines, annulant d’importants changements post-traductionnels dans les voies immunitaires innées ciblant les virus et les voies de signalisation inflammatoires. En effet, PLpro perturbe ces voies. Ces effets augmentent sa valeur pour la réplication virale, ce qui en fait une excellente cible pour le développement antiviral.
Bien que similaire à bien des égards au PLpro codé par SARS-CoV, il a une structure qui pourrait être comparée à celle d’une main ouverte, avec des sous-domaines correspondant au pouce, à la paume et aux doigts pour engager son substrat, formant le site S1. L’étude actuelle explore le site enzymatique de nsp3 ainsi que l’activité protéase de la protéine pleine longueur.
PLpro moins actif que Nsp3
Les chercheurs ont découvert que la nsp3 est une protéase plus active que PLpro, qui était incapable de cliver la nsp1-2 pour libérer la nsp1, même à des concentrations croissantes de PLpro.
Cependant, une version étendue de nsp3 était capable de cliver activement les trois substrats, tout en maintenant la spécificité enzymatique et en dépit de ne pas posséder de sites catalytiques supplémentaires au-delà de PLpro. De plus, nsp3 montre un clivage plus rapide et plus complet des deux autres substrats par rapport à PLpro.
Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre la structure de variantes de nsp3 plus longues, seules ou en complexe avec l’un de ses substrats. L’interactome de cette protéine est également mal compris.
Les scientifiques ont donc utilisé un modèle tronqué pour obtenir un niveau d’expression suffisamment élevé dans les cellules, car la molécule pleine longueur était exprimée à de très faibles concentrations.
Activité Nsp3 liée à la fonction immunitaire innée
En examinant les interactions à la fois de PLpro et de nsp3 – la version tronquée – ils ont constaté que de nombreuses protéines en interaction présentaient une tendance commune à être stimulées par des interférons et par des protéines de signalisation antivirales. ISG15 était également une protéine d’interaction significative, avec IFIT1 et IFIT2, les deux protéines induites par l’interféron qui détectent les ARN viraux simple brin pour empêcher l’expression des ARNm viraux. Plusieurs autres protéines antivirales et liées à l’interféron se sont également révélées interagir avec les deux protéases.
D’autres interacteurs ont été associés à la traduction, principalement pour les deux protéines, mais dans un ou deux cas, avec un seul, comme la protéine 1 liée au syndrome de retard mental X fragile (FXR1). Des interacteurs nsp3 uniques peuvent avoir été manqués en raison de l’absence d’une partie du nsp3 dans cette version tronquée, empêchant son trafic vers les bons compartiments subcellulaires, ou parce qu’il s’agit d’un intermédiaire, médiant la liaison d’autres nsps pour créer des complexes de réplication.
Mauvaise corrélation entre les études sur les inhibiteurs in vitro et cellulaires
Les scientifiques ont utilisé un test à haut débit pour cribler environ 2000 composés approuvés par la FDA afin de trouver des médicaments potentiels susceptibles d’inhiber cette enzyme à de faibles concentrations. Ils ont identifié cinq composés qui pourraient inhiber à la fois PLpro et nsp3. Cela comprenait la thioguanine, l’acide nordihydroguaiarétique, le disulfirame, l’auranofine et le tideglusib.
Malgré leurs bonnes performances in vitro, aucune des molécules criblées n’a rempli sa promesse, échouant à inhiber la réplication virale dans un modèle cellulaire. Cela met non seulement en évidence les limites de la réutilisation des médicaments pour trouver des composés principaux, mais également la nécessité d’utiliser la nsp3 pour le dépistage. Ceci est dû au fait que PLpro n’est pas capable de clivage efficace des polypeptides viraux, alors que nsp3 le peut.
L’utilisation de Nsp3 aidera à identifier les inhibiteurs allostériques qui peuvent empêcher la protéolyse des trois substrats par nsp3. Encore une fois, la combinaison d’inhibiteurs de PLpro en combinaison avec Mpro et d’autres ARN polymérases essentielles dépendant de l’ARN peut aider à parvenir à une stratégie thérapeutique antivirale plus efficace. Non seulement les inhibiteurs identifiés étaient inefficaces dans les dosages cellulaires, mais ils ont montré des effets hors cible sur d’autres molécules de type ubiquitine.
Nanobodies de liaison PLpro
Les chercheurs ont donc construit des nanocorps liant PLpro qui se lient au site S1 avec une affinité élevée, inhibant PLpro. Celles-ci se sont avérées probablement spécifiques dans leur liaison à ce site. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour démontrer leur structure.
Quelles sont les implications?
Les chercheurs ont pu découvrir des différences pertinentes dans l’activité protéase de la nsp3 et de la région catalytique PLpro seule. Leurs travaux suggèrent l’importance de mesurer la capacité inhibitrice des composés de tête de médicament potentiels sur la nsp3 pleine longueur ainsi que la capacité à empêcher le clivage des polypeptides viraux.
De plus, les nanocorps développés ici pourraient grandement aider à examiner les substrats cellulaires de nsp3 et son mécanisme de travail sur les trois substrats.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.